本发明专利技术公开了一种焦磷酸测序法检测牙釉质蛋白基因进行性别鉴定的试剂盒及方法。所述试剂盒，其包括：ＰＣＲ缓冲溶液、ＴａｑＤＮＡ聚合酶、引物、模板ＤＮＡ，焦磷酸测序试剂盒、磁珠、结合缓冲溶液、洗涤缓冲溶液、退火缓冲溶液和变性缓冲溶液；所述引物由ＰＣＲ扩增引物和测序引物组成；所述ＰＣＲ扩增引物的碱基序列为：上游引物ＡＴＴＧＡＡＴＣＣＣＡＡＧＴＡＡＴＣ，下游引物ＧＡＣＴＡＧＡＡＴＡＧＣＣＡＡＴＧＡＴ，所述测序引物的碱基序列为ＡＴＴＧＡＡＴＣＣＣＡＡＧＴＡＡＴＣ。测试方法按照下列步骤进行：提取ＤＮＡ、ＰＣＲ扩增、确定喷碱基顺序为ＣＴＧＡＴＣＴＧＡＣ、单链分离纯化、焦磷酸测序反应和确定反应产物。采用本发明专利技术进行性别鉴别，是现有鉴定方法的有益补充。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及人类基因检测，特别涉及短片段序列的测序分析，具体地说是采用焦 磷酸测序法检测短片段牙釉质蛋白基因进行性别鉴定的试剂盒及方法。
技术介绍
在法医学实践中，常遇到肢解尸体、高度腐败以及白骨化尸体；在大规模灾难事故 中常多人罹难，尸体外表严重毁坏，均对个人识别和性别鉴定造成一定难度。由于在这一类 案件中，无法运用形态学的方法进行性别的判断，所以，应用分子生物学的方法对来自人体 的生物学检材进行性别鉴定，对案件的侦破起到了重要作用。此外，在一些临床诊断中如胎 儿早期诊断和考古学白骨化尸体的鉴别，也都需要区分性别。牙釉质蛋白基因(amelogenin)，位于人类X染色体p22，编码牙釉质蛋白，并且在Y 染色体中心粒附近分布与牙釉质蛋白基因的序列具有90%的同源性的基因。在这两段同源 序列中，存在很多多态性位点，同时又有足够长的同源序列设计引物，即用一对引物在一个 PCR反应中同时扩增X、Y染色体上的牙釉质蛋白基因，可实现性别判定。1991年，Nakahori 等就已报道用牙釉质蛋白基因的一对同源引物进行性别鉴定。此外，Akane(1991), Bailey (1992), Sullivan (1993)等也先后都用PCR扩增单拷贝X、Y同源区域进行性别测 定。目前最常用的牙釉质蛋白基因的检测方法就是Sullivan法——用同一对引物扩增X、 Y同源的牙釉质蛋白基因，引物旁侧同源区内含子1有6-bp的缺失，扩增产物X染色体为 106bp，Y染色体为112bp。然而该方法也有其局限性，当被检样品在牙釉质蛋白基因引物结 合区存在突变，或者对于性染色体变异的个体，Sullivan法检测易导致无效扩增。而且对 于一些疑难案件的高度降解检材而言，该方法的片段长度还是稍显过长以至于不能做出正 确的判型。大量研究表明，高度降解DNA检材的检测成功率随PCR扩增产物片段缩短而增 尚o
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是针对常规分型失败的性别鉴定，提供一种焦磷酸测序 法检测牙釉质蛋白基因进行性别鉴定的试剂盒及方法，使检测DNA的片段缩短至44/45bp， 并且包含3个突变位点和一个插入缺失位点，提高对高度降解DNA分型的成功率。为解决上述技术问题，本专利技术所采取的技术方案是焦磷酸测序法检测牙釉质 蛋白基因进行性别鉴定的试剂盒，其包括PCR缓冲溶液、TaqDNA聚合酶、引物、模板DNA， 焦磷酸测序试剂盒、磁珠、结合缓冲溶液、洗涤缓冲溶液、退火缓冲溶液和变性缓冲溶液； 所述引物由PCR扩增引物和测序引物组成；所述PCR扩增引物的碱基序列为上游引 物ATTGAATCCCAAGTAATC，下游引物GACTAGAATAGCCAATGAT，所述测序引物的碱基序列为 ATTGAATCCCAAGTAATC，所述下游引物标记生物素。利用上述试剂盒进行性别鉴定的测试方法，按照下述步骤进行a)提取DNA，得DNA提取液；b) PCR 扩增在PCR扩增体系中加入步骤a)中得到的DNA提取液进行PCR扩增，PCR扩增条件 为95°C、5min预变性；然后依次在95°C、15s，50°C、30s，72°C、15s，进行45个循环；再在 72°C保持5min，最终保持在4°C，得扩增产物；C)确定喷碱基顺序为CTGATCTGAC ；d)单链分离纯化将步骤b)所得的扩增产物加入结合缓冲溶液和含有偶链亲和素的磁珠，在常温 下孵育20min ；然后将扩增产物分别在体积比为70%酒精洗涤5秒、变性缓冲液中变性15 秒、洗涤缓冲液中洗涤15秒，上述扩增产物变为单链DNA模板，再将所述单链DNA模板转入 含有测序引物的退火缓冲溶液中，在80°C杂交3min，冷却至室温，得分离纯化后的单链DNA 模板；e)焦磷酸测序反应准备好焦磷酸测序反应所用的酶混合物、底物混合物及dNTP，加入试剂舱，将步骤 d)中所得的分离纯化后的单链DNA模板放入焦磷酸测序仪，按照步骤c)中设计的喷碱基顺 序进行焦磷酸测序反应；f)确定反应产物仪器自动对测序结果进行判读，根据测序图谱及结果获得性别信息。按照上述步骤生成的靶序列分别为靴序列X :ATTGAATCCCAAGTAATCGGT-GCCTATCATTGGCTATTCTAGTC ；或靴序列Y :ATTGAATCCCAAGTAATCTGACGACTATCATTGGCTATTCTAGTC。其相关信息为X染色体上AMELX的Genbank号为NG_012040，位于11637-11686 ； Y染色体上AMELY的Genbank号为NG_008011，位于12395-12445。所述靶序列的选择标准 ⑴小于50bp ；⑵有足够长的同源序列设计引物，即上下游同源区大于18bp ； (3)多个点 突变和插入缺失位点共同存在；(4)适合设计PCR扩增引物及测序引物。上述的方法和试剂盒可以用于分析来自人类的血液、骨骼、毛发、肌肉或者组织器 官的DNA样品。下面采用上述方法对100份已知性别的健康无关个体样本(男女各50份)，进行 测序分析，验证该方法的准确性按照常规方法提取100份个体的血液样本，用本专利技术设计 的引物进行扩增，再应用焦磷酸测序技术对扩增产物进行测序，从测序图即可直接判型。检测结果参见图1-1、图1-2，从图1-1和图1-2的测序结果可看出，AMELX的特异 序列为GGTGC，AMELY的特异序列为TGACGA ；二者的差异为3个点突变位点——G/T，T/A，C/A，和一个插入缺失位点----/C。因此，女性(XX)的测序结果为G/G、T/T、…/…、C/C(参见图1-1)，男性(XY)的测序结果为G/T、T/A、…/〔、(/^参见图1-2)；图1_1和 图1-2分别与图2-1和2-2测序软件设计的预期模型一致。对这100份已知性别DNA样本 进行测序，均得到正确的分型，分型成功率为100%。采用上述方法可对高度降解的检材进行准确分型，完成对不同个体的性别鉴定。 下面通过试验数据来说明本专利技术的优势。对比试验1按照常规方法提取8份室外自然条件下放置26周腐败降解的血液样本的DNA，然 后分别采用Ampf/STR Identifiler试剂盒和本专利技术的试剂盒对提取的DNA进行牙釉质蛋 白基因的检测。采用本专利技术的试剂盒和检测方法，8份样本均可正确分型，检测结果参见图 3-la和图3-lb ；而采用Ampf/STR Identifiler试剂盒其中有2份样本无法分型，参见图 3-2a 和图 3-2b。比对试验2用DNase I 制备 9 个不同时间点(5min、lOmin、15min、20min、25min、30min、40min 和45min)的人工降解DNA，然后分别采用Ampf/STR Identifiler试剂盒的方法和本专利技术的 试剂盒和方法对人工降解DNA进行牙釉质蛋白基因的检测。采用本专利技术的试剂盒和方法的检测结果见图4-1 图4-10，其中图4-1为对比图 谱；可以看出，对酶消化 5min、lOmin、15min、20min、25min、30min、35min 和 40min 的 DNA，本 专利技术建立的方法均可对降解DNA进行正确分型，对酶消化45min的DNA，该方法检测未得到 产物峰。采用AmpF/STR Id本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种焦磷酸测序法检测牙釉质蛋白基因进行性别鉴定的试剂盒，其包括：ＰＣＲ缓冲溶液、ＴａｑＤＮＡ聚合酶、引物、模板ＤＮＡ，焦磷酸测序试剂盒、磁珠、结合缓冲溶液、洗涤缓冲溶液、退火缓冲溶液和变性缓冲溶液；其特征在于所述引物由ＰＣＲ扩增引物和测序引物组成；所述ＰＣＲ扩增引物的碱基序列为：上游引物ＡＴＴＧＡＡＴＣＣＣＡＡＧＴＡＡＴＣ，下游引物ＧＡＣＴＡＧＡＡＴＡＧＣＣＡＡＴＧＡＴ，所述测序引物的碱基序列为ＡＴＴＧＡＡＴＣＣＣＡＡＧＴＡＡＴＣ，所述下游引物标记生物素。
【技术特征摘要】
一种焦磷酸测序法检测牙釉质蛋白基因进行性别鉴定的试剂盒，其包括PCR缓冲溶液、TaqDNA聚合酶、引物、模板DNA，焦磷酸测序试剂盒、磁珠、结合缓冲溶液、洗涤缓冲溶液、退火缓冲溶液和变性缓冲溶液；其特征在于所述引物由PCR扩增引物和测序引物组成；所述PCR扩增引物的碱基序列为上游引物ATTGAATCCCAAGTAATC，下游引物GACTAGAATAGCCAATGAT，所述测序引物的碱基序列为ATTGAATCCCAAGTAATC，所述下游引物标记生物素。2.利用权利要求1所述的试剂盒进行性别鉴定的测试方法，其特征在于，按照下述步 骤进行a)提取DNA，得DNA提取液；b)PCR扩增在PCR扩增体系中加入步骤a)中得到的DNA提取液进行PCR扩增，PCR扩增条件为 95°C、5min预变性；然后依次在95°C、15s，50°C、30s，72°C、15s，...
【专利技术属性】
技术研发人员：李淑瑾，丛斌，冯婷，
申请(专利权)人：河北医科大学，
类型：发明
国别省市：13[中国|河北]
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