一种凡纳滨对虾ｆｘ１５１微卫星ＤＮＡ标记鉴定ｆｘ１５１遗传变异图谱的方法技术

一种凡纳滨对虾ｆｘ１５１微卫星ＤＮＡ标记鉴定ｆｘ１５１遗传变异图谱方法，其特征在于包括以下步骤：先提取凡纳滨对虾基因组并稀释备用，再利用凡纳滨对虾ｆｘ１５１微卫星ＤＮＡ核心序列，在其序列两端设计特异性引物，然后使用该引物对凡纳滨对虾不同群体或者群体内个体的基因组ＤＮＡ进行ＰＣＲ扩增，对ＰＣＲ产物进行变性聚丙烯酰胺凝胶检测；利用产物出现的条带银染显色后进行分析，确定每个个体的基因型，从而获得凡纳滨对虾在ｆｘ１５１遗传标记基因座位的多态性遗传变异图谱。本发明专利技术可快捷的获得凡纳滨对虾ｆｘ１５１遗传标记基因座位呈现高度遗传变异的多态性图谱，方便简单，所得结果可直观检测出凡纳滨对虾每个个体的基因型。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于分子生物学DNA标记技术与应用领域，具体涉及海洋经济动物对虾属 凡纳滨对虾ilitopenaeus vannamei) fxl51微卫星DNA标记的鉴定遗传变异图谱的方法。
技术介绍
凡 内 宾)(寸虫下{Li topenaeus vannamei )，俗称南美白对虾iPermeus vannamei)， 属节肢动物门(Arthropoda)、甲壳纲(fr^siacea)、十足目(Mecapoda、、游泳亚目 (Na tan tia )、对虾科 QPenaeidae )、对虾属 iPenseus )、Li to-penaeus 亚属，是广温广盐性热 带虾类，是目前世界上三大养殖对虾(中国对虾、斑节对虾、凡纳滨对虾)中单产量最高的虾 种，在对虾渔业及养殖业中占有重要地位。1988年7月，凡纳滨对虾由中国科学院海洋研究所从美国夏威夷引进我国，1992 年8月人工繁殖获得了初步的成功，1994年通过人工育苗获得了小批量的虾苗，1999年深 圳天俊实业股份有限公司与美国三高海洋生物技术公司合作，引进美SPF凡纳滨对虾种虾 和繁育技术，成功地培育出了 SPF凡纳滨对虾苗。至此，凡纳滨对虾在我国被广泛养殖。近年来，凡纳滨对虾在我国不论是海水，还是低盐度海水及 淡水中养殖都取得了一定的进展。目前，凡纳滨对虾已是我国养殖对虾的绝对优势品种。 2007年，我国凡纳滨对虾养殖产量101万吨，占我国对虾养殖产量的80 %，同年，我国对 虾养殖产量126万吨，占世界对虾养殖总产量的37 %。但病害和养殖使得凡纳滨对虾资源 迅速衰减，尤其自90年代虾病爆发以来，凡纳滨对虾养殖业受到重挫，虾病的流行使抗病 品系选育成为必要和需要解决的问题。本专利技术做出之前，国内外有类似的研究报告，国内中科院海洋研究所徐鹏等 (2001)发表的《中国对虾微卫星DNA的筛选》，张留所(2006)等发表的《凡纳滨对虾分子标 记筛选、连锁图谱构建和QTL定位》国外Franklin P6rez等(2005)在凡纳滨对虾中找到了 112对微卫星，目前，利用微卫星标记在凡纳滨对虾多态性图谱的构建、特异性遗传标记等 方面的应用尚未报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了简便快速的鉴定凡纳滨对虾fxl51遗传标记基因座位的遗 传变异图谱，丰富现有的凡纳滨对虾微卫星标记，寻找更多的多态性好、稳定性高的微卫星 标记，提供了一种凡纳滨对虾fxl51微卫星DNA标记鉴定fxl51遗传变异图谱的方法。本专利技术是通过以下方案实现的一种凡纳滨对虾fxl51微卫星DNA标记鉴定 fxl51遗传变异图谱的方法，其特征在于包括以下步骤首先提取凡纳滨对虾基因组并稀 释备用，再利用凡纳滨对虾fxl51微卫星DNA核心序列，在其序列两端设计特异性引物 ’然 后使用该引物对凡纳滨对虾不同群体或者群体内个体的基因组DNA进行PCR扩增，对PCR 产物进行变性聚丙烯酰胺凝胶检测；利用产物出现的条带银染显色后进行分析，确定每个3个体的基因型，从而获得凡纳滨对虾在fxl51遗传标记基因座位的的多态性遗传变异图谱 (如图1所示)。提取凡纳滨对虾基因组DNA，将其稀释成50ng/ul，每个反应加入Iul，反应总体积 为 20ul。fxl51微卫星DNA序列的特异性引物核苷酸序列分别为正链5’ -TGCCAATAAACAAGTTGAGCC _3，，负链 5，- GTTACTCATTACTTGCCTTCC _3，，退火温度为 50C。其PCR反应加样参数为正反向引物各为0.2 uM, 0.2 mM dNTP, 1*PCR Buffer, 2.0 mM Mg2+，0.6 U Taq酶，50 ng DNA模板，用双蒸水补足到20ul。使用该引物的时设置 PCR程序参数为94°C预变性5min ；然后94°C变性30s，50°C退火1 min，72°C延伸1 min， 重复这个循环35次；之后延伸5 min,4 °C保存。PCR产物的检测基因组DNA模板进行PCR扩增，其产物在聚丙烯酰胺凝胶上电 泳，利用长度差异为50 bp的DNA ladder及PBR322 Marker (上海生工)作为分子量标记， 扩增产物用6%-8%的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳-银染系统进行检测PCR产物中加上变性 Buffer之后95°C变性5分钟，之后立刻置于冰上降温，使用微量进样器上样5ul，85 W恒 功率电泳至溴酚兰带至胶板的底端，约120分钟，1%。的硝酸银染色，显色液(30 g NaOH, 0. 5g四硼酸钠，8 ml 37 %的甲醛溶解至2 L超纯水)显色，超纯水终止显色，干燥放在 UTA-2100XL型号扫描仪中扫描保存图片，分析多态性，确定各个个体的基因型，并进一步 得到凡纳滨对虾fxl51遗传标记基因座位的多态性图谱。本专利技术适用于凡纳滨对虾种质资源和遗传多样性分析，家系鉴定，分子群体遗传 学，遗传图谱的构建，重要经济性状的定位，功能基因的研究，进一步用于辅助凡纳滨对虾 分子遗传育种和养殖。现有的凡纳滨对虾微卫星标记还不够丰富，建立凡纳滨对虾遗传连锁图谱，物理 图谱，以及QTL定位需要更多的多态性好、稳定性高的微卫星标记。与现有技术相比，本发 明具有以下优点(1)本专利技术可以简便快速的鉴定凡纳滨对虾fxl51微卫星遗传标记基因座位的遗传变 异图谱，方法简便，所得结果可直观的检测出凡纳滨对虾每个个体的基因型。(2)本专利技术的核心是fxl51微卫星DNA标记特异性引物，其核苷酸序列为正链 5，- TGCCAATAAACAAGTTGAGCC _3，，负链 5，- GTTACTCATTACTTGCCTTCC _3，，可在凡纳滨对 虾总群检测中呈现高度遗传变异的多态性。(3)本专利技术主要应用于凡纳滨对虾种质资源和遗传多样性分析，家系鉴定， 分子群体遗传学，遗传图谱的构建，重要经济性状的定位，功能基因的研究。附图说明图1本专利技术的fxl51微卫星DNA标记在57尾凡纳滨对虾个体中的基因型图谱，编 号1-57为凡纳滨对虾的57个个体，M为PBR322标准分子量。具体实施方式 实施例首先提取凡纳滨对虾基因组并稀释备用，再利用凡纳滨对虾fxl51微卫星DNA核 心序列，在其序列两端设计特异性引物；然后使用该引物对凡纳滨对虾不同群体或者群体 内个体的基因组DNA进行PCR扩增，对PCR产物进行变性聚丙烯酰胺凝胶检测；利用产物出 现的条带银染显色后进行分析，确定每个个体的基因型，从而获得凡纳滨对虾在fxl51遗 传标记基因座位的多态性图谱(如图1所示)。1提取凡纳滨对虾基因组1)取凡纳滨对虾肌肉30mg置于2.0 ml的离心管中，剪碎，加入600 ul STE裂解缓冲 液(100 mmol/L NaCl,10 mmol/L Tris-Cl, ρΗ 8.0 ；1 mmol/L EDTA, pH 8.0)，50 μ 1 SDS 以及5 μ 1蛋白酶K (20mg/ml)，混勻2)56。C消化处理，直到裂解液澄清，6000rpm离心3 min3)取上清，加入等体积饱和酚(250μ 1)、氯仿/异戊醇(24:1) (250 μ )，轻轻上下 颠倒混勻数分钟，抽提去除蛋白，10000转离心10 min4)取上清液，重复一次步骤3，直至水相和本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种凡纳滨对虾ｆｘ１５１微卫星ＤＮＡ标记鉴定ｆｘ１５１遗传变异图谱的方法，其特征在于包括以下步骤：先提取凡纳滨对虾基因组并稀释备用，再利用凡纳滨对虾ｆｘ１５１微卫星ＤＮＡ核心序列（ＴＴＧＣ）ｎ，其中ｎ＝５－１０，在其序列两端设计特异性引物，其核苷酸序列如ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１－２所示；然后使用该引物对凡纳滨对虾不同群体或者群体内个体的基因组ＤＮＡ进行ＰＣＲ扩增，对ＰＣＲ产物进行变性聚丙烯酰胺凝胶检测；利用产物出现的条带银染显色后进行分析，确定每个个体的基因型，从而获得凡纳滨对虾在ｆｘ１５１遗传标记基因座位的多态性遗传变异图谱。

【技术特征摘要】
一种凡纳滨对虾fx151微卫星DNA标记鉴定fx151遗传变异图谱的方法，其特征在于包括以下步骤先提取凡纳滨对虾基因组并稀释备用，再利用凡纳滨对虾fx151微卫星DNA核心序列(TTGC)n, 其中n=5 10，在其序列两端设计特异性引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO1 2所示；然后使用该引物对凡纳滨对虾不同群体或者群体内个体的基因组DNA进行PCR扩增，对PCR产物进行变性聚丙烯酰胺凝胶检测；利用产物出现的条带银染显色后进行分析，确定每个个体的基因型，从而获得凡纳滨对虾在fx151遗传标记基因座位的多态性遗传变异图谱。2.根据权利要求1所述的凡纳滨对虾fxl51微卫星DNA标记鉴定fxl51遗传变异图谱 的方法，其特征在于其PCR反应加样参数为正反向引物各为0.2 uM，0. 2 mM dNTP, 1*PCR Buffer, 2. 0 mM Mg2+，0. 6 U Taq酶，50 ng DNA模板，用双蒸水补足到20ul ；使用该引物的 时设置PCR程序参数为94°C预变性5分钟；然后94°C变性30秒，50°C退火1分钟，72°C 延伸1分钟，重复这个循环35次；之后延伸5分钟。3.根...

【专利技术属性】
技术研发人员：吕玲，李朝政，翁少萍，何建国，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]