一种山羊产羔性状的分子标记选择方法，以山羊基因组ＤＮＡ序列为模板，在ＴａｑＤＮＡ聚合酶、缓冲环境、Ｍｇ２＋、ｄＮＴＰｓ存在的情况下，利用引物Ｐ１和Ｐ２在ＰＣＲ条件下分别扩增ＫＩＴＬ基因内含子１和６，根据琼脂糖凝胶电泳结果判定目的片段的大小；用限制性内切酶ＣｖｉＡⅡ消化引物Ｐ１的ＰＣＲ扩增产物后，再用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测酶切后的扩增片段，引物Ｐ１的扩增产物存在２个碱基的突变；采用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测引物Ｐ２的ＰＣＲ扩增产物，引物Ｐ２的扩增产物存在１个碱基的突变，然后对引物Ｐ１和Ｐ２的扩增产物进行基因分型和基因频率分析，以及与关中奶山羊、西农萨能奶山羊和布尔山羊的产羔数之间进行关联分析，表明ＫＩＴＬ基因由引物Ｐ１和Ｐ２检测的ＳＮＰｓ位点可作为山羊产羔数性状选择的分子标记。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子遗传学领域，具体涉及， 该方法采用检测山羊干细胞因子(Kit ligand, KITL)基因内含子1和6碱基突变多态性， 并分析其对产羔数的影响，结果表明=KITL基因由引物Pl和P2检测的SNPs位点可作为山 羊产羔性状选择分子标记。
技术介绍
随着分子生物学技术的迅速发展，尤其是聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)技术的问世和电泳技术的改进，各种分子遗传标记技术随之兴起，这些技术 给家畜的遗传改良和新品种的培育提供了新的途径和方法。特别是分子标记技术与常 规育种技术相结合，孕育出一种全新的选种方式一标记辅助选择法(Marker assistant selection)。它可以克服传统选种过程中根据表型选择导致的环境偏差和抽样误差，提高 家畜选种的准确性和高效性，加快优良品种的选育，进一步推动我国畜牧业的发展。单核苷酸多态性(SingleNucleotide Polymorphisms, SNP)就是指基因组 DNA 序列中由于单个核苷酸(A/T/C/G)的替换而引起的多态性。SNPs可以是两个或多个等位基 因的多态，因此，通常所说的SNPs包括碱基的插入、缺失、插入/缺失以及重复序列拷贝数 的变化。一个SNP表示在基因组某个位点上有一个核苷酸的变化，主要由单个碱基的转换 (以一种嘧啶置换另一种嘧啶或一种嘌呤置换另一种嘌呤)以及颠换(嘌呤与嘧啶互换)所 引起。具有颠换型变异的SNPs约占2/3，其他几种SNP在相似的水平上，因为CpG (核苷酸 对，其中G在DNA链中紧随C后)二核苷酸的胞嘧啶是基因组中最易发生突变的位点，其中 大多数是甲基化的，可自发地脱去氨基而形成胸腺嘧啶。在任何已知或未知的基因内或附 近都可能找到数量不等的SNPs，根据它们在基因组中分布的位置可分为基因编码区SNPs (cSNPs)、基因周边SNPs (pSNPs)和基因间SNPs (iSNPs)等三类。总的说来，cSNP比较少， 因为在编码区内的变异率仅占有周围序列的1/5，但它在遗传病和育种的研究中却具重要 意义，因此倍受关注。根据对遗传性状的影响，cSNPs又可分为两种一种是同义cSNPs，即 SNP所致编码序列的改变并不影响其所翻译的氨基酸序列，突变碱基与未突变碱基的“含 义”相同；另一种是非同义cSNPs，即碱基序列的改变将导致编码氨基酸的改变从而产生蛋 白质序列的改变，可能最终影响到蛋白质的功能。因此，对编码区SNPs的非同义突变来说， 它们可能对基因功能有直接的重要影响，尤其对于编码区突变来说，更可能会导致所编码 的蛋白发生重大变化，从而影响它的功能的发挥。基因序列上碱基的插入/缺失突变，同样 将导致所编码氨基酸的改变从而产生蛋白质序列改变，以致影响到蛋白的生物学功能，从 而造成对个体的表现型具有重要影响。不仅如此，在群体遗传研究中，这些SNPs作为遗传 标记在群体遗传和生物进化的研究中也具有重要意义。由于SNPs是二等位基因分子标记，所以，理论上在一个二倍体生物群体中，SNPs 可能是由2个、3个或4个等位基因构成，但实际上3个或4个等位基因的SNPs很罕见， 故SNPs通常被简单地称为二等位基因分子标记。目前，主要采用几种不同的路线来发现SNPs 即DNA序列测定方法、PCR-SSCP与DNA测序结合法、AS-PCR方法、引物延伸法和寡核 苷酸连接反应等。在这些SNP检测技术中，DNA序列测定法是最为准确的SNP检测方法， 但是，其检测费用极其昂贵，且需要有DNA测序仪等大型仪器，同时，在测序过程中需要非 常熟练的技术人员和经验，所以，DNA序列测定法不是一种应用于生产实际的理想SNP检 测方法；当然，利用PCR-SSCP与DNA测序结合法检测SNP可以适当降低检测费用，但是， PCR-SSCP的实验过程比较长，操作比较繁琐，且实验过程中存在假阴性问题，所以，也并非 理想的SNP检测手段；AS-PCR方法作为一种新型的SNP检测方法，在未来的应用领域中具 有非常广阔的前景，但是，该方法需要设计特别的引物，且只能针对特定的基因位点，同时， 检测过程中还存在误检的概率，因此，目前不具有普遍应用的特点；而引物延伸法和寡核苷 酸连接反应技术检测SNP位点，需要平板读数仪、基因芯片、微球阵列技术和质谱仪等检测 平台，对于一般的分子实验室来说可实施性不强。Kit是976个氨基酸的蛋白，属于跨膜酪氨酸激酶受体家族III型，其成熟蛋白的 分子量为 125 160kDa。Kit 的配体 KitL (Kit ligand, stem cell factor, SCF)是 248 个氨基酸的单体，其中189个氨基酸在胞外域，23个氨基酸在跨膜部分，36个氨基酸在胞质 区。KitL存在两种不同的形式，可溶性KitL (KitLl)和膜结合KitL (KitL2)。Kit和KitL 在造血干细胞和肥大细胞的维持和生存上起作用。Kit和KitL还在配子形成、黑素形成、血 细胞形成过程中起重要作用。Kit和KitL分别由Steel和White spotting基因编码，这两 个位点突变的小鼠可以证明，Kit和KitL在PGCs的生存、迁移、增殖以及卵泡的发育中起 作用。KitL通过与Kit结合，激活了调节细胞凋亡的信号通路，并激活了 PI3K通路，PI3K 通路在卵母细胞生长中起重要的调节作用。在小鼠卵巢中，Kit在膜细胞和卵母细胞中表达，而KitL在颗粒细胞中表达。Kit 在卵子发生时期的卵原细胞有丝分裂过程中大量表达，并且在卵母细胞发育的所有时期都 表达。KitL mRNA在早期有腔卵泡的颗粒细胞中表达很高，在后期有腔卵泡的颗粒细胞中表 达下降。卵母细胞与颗粒细胞之间存在着重要的相互作用。卵母细胞在生长、增殖、成熟和 受精的全过程中始终与颗粒细胞通过间隙连接保持着联系，这种联系对卵母细胞和颗粒细 胞的生长和增生都很重要。因此，Kit和KitL这一对受体-配体的相互作用，在卵母细胞 和颗粒细胞的相互作用中也有着重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于，提供一种，该方法采 用检测山羊干细胞因子(Kit ligand,KITL)基因内含子1和6碱基突变多态性，并分析多态 性与关中奶山羊、西农萨能奶山羊和布尔山羊的产羔性状之间的关系；结果表明KITL基 因由引物Pl和P2检测的SNPs位点可作为山羊产羔性状选择的分子标记。为了实现上述任务，本专利技术采取如下的技术解决方案，其特征在于，包括下列步骤 1)以山羊基因组DNA为模板，在Taq DNA聚合酶、缓冲环境、Mg2+、dNTPs存在的情况下， 利用引物Pl和P2在PCR条件下进行扩增，筛查山羊KITL基因内含子2和6的碱基突变； 所述的引物Pl如下上游引物 1F:5' - TTCCTATGAGGTTACCAATG -3'；下游引物 IR 5' - GTAGGCTAAACCTTGTCTTGT -3，。所述的引物P2如下上游引物 2F 5 ‘ - AGAGTTCACAAGACAAGGTT -3 ‘； 下游引物 2R 5' - ATTAGGTTACTGGCGTTATG -3，。所述的PCR扩增的条件是15 μ L反应体系，包括10 μ本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种山羊产羔性状的分子标记选择方法，其特征在于，包括下列步骤：１）以山羊基因组ＤＮＡ为模板，在Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶、缓冲环境、Ｍｇ↑［２＋］、ｄＮＴＰｓ存在的情况下，利用引物Ｐ１和Ｐ２在ＰＣＲ条件下进行扩增，筛查山羊ＫＩＴＬ基因内含子１和６的碱基突变； 所述的引物Ｐ１如下： 上游引物１Ｆ：５′－ＴＴＣＣＴＡＴＧＡＧＧＴＴＡＣＣＡＡＴＧ－３′； 下游引物１Ｒ：５＇－ＧＴＡＧＧＣＴＡＡＡＣＣＴＴＧＴＣＴＴＧＴ－３＇。 所述的引物Ｐ２如下： 上游引物２Ｆ：５′－ＡＧＡＧＴＴＣＡＣＡＡＧＡＣＡＡＧＧＴＴ－３′； 下游引物２Ｒ：５＇－ＡＴＴＡＧＧＴＴＡＣＴＧＧＣＧＴＴＡＴＧ－３＇； 所述的ＰＣＲ扩增的条件是：１５μＬ反应体系，包括：１０μｍｏｌ／Ｌ的引物Ｐ１、Ｐ２的上下游引物各０．６ μＬ；２×Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｍｉｘ ５．８２５ μＬ；ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ０．１２５μＬ（２．５ Ｕ／μＬ）；５０ ｎｇ／μＬ ＤＮＡ模板０．６ μＬ；超纯水７．２５ μＬ。 所述的ＰＣＲ扩增反应程序如下： 利用引物Ｐ１的ＰＣＲ扩增反应程序为：９５℃预变性５ ｍｉｎ，９４℃变性３０ｓ，４９．６℃退火４０ｓ，７２℃延伸４０ｓ，共进行３６个循环，最后７２℃充分延伸１０ｍｉｎ，４℃保存； 利用引物Ｐ２的ＰＣＲ扩增反应程序为：９５℃预变性５ ｍｉｎ，９４℃变性３０ｓ，５６．７℃退火３５ｓ，７２℃延伸３５ｓ，共进行３６个循环，最后７２℃充分延伸１０ｍｉｎ，４℃保存； ２）根据琼脂糖凝胶电泳对引物Ｐ１和引物Ｐ２的ＰＣＲ扩增产物进行大小判定，用限制性内切酶ＣｖｉＡⅡ消化引物Ｐ１的ＰＣＲ扩增产物之后，再采用１０％聚丙烯酰胺凝胶电泳检测酶切后的扩增片段，发现引物Ｐ１的ＰＣＲ扩增产物存在２个碱基的突变，即３１６ｂｐ处有一个Ｔ→Ｃ的突变Ｌ１位点，３６３ｂｐ处有一个Ｇ→Ｔ的突变Ｌ２位点；采用１０％聚丙烯酰胺凝胶电泳检测Ｐ２的ＰＣＲ扩增产物，引物Ｐ２扩增产物存在１个碱基的突变，即２４９ｂｐ处有一个Ｇ→Ｃ的突变Ｌ３位点； ３）对引物Ｐ１和引物Ｐ２的ＰＣＲ扩增产物进行基因分型和基因频率分析，以及与关中奶山羊、西农萨能奶山羊和布尔山羊的产羔数之间进行关联分析结果如下： 在Ｌ１位点，纯合型Ｔ↓［１］Ｔ↓［１］在３１６ｂｐ位的碱基是Ｔ，杂合型Ｔ↓［１］Ｃ↓［１］在３１６ｂｐ位的碱基是Ｔ＼Ｃ，纯合型Ｃ↓［１］Ｃ↓［１］在３１６ｂｐ位的碱基是Ｃ； 在Ｌ２位点，纯合型Ｇ↓［２］Ｇ↓［２］在３６３ｂｐ位的碱基是Ｇ，杂合型Ｇ↓［２］Ｔ↓［２］在３６３ｂｐ位的碱基是Ｇ＼Ｔ，纯合型Ｔ↓［２］Ｔ↓［２］在３６３ｂｐ位的碱基是Ｔ； 在Ｌ３位点，纯合型Ｇ↓［３］Ｇ↓［３］在２４９ｂｐ位的碱基是Ｇ，杂合型Ｇ↓［３］Ｃ↓［３］在２４９ｂｐ位的碱基是Ｇ＼Ｃ，纯合型Ｃ↓［３］Ｃ↓［３］在２４９ｂｐ位的碱基是Ｃ。...
【技术特征摘要】
一种山羊产羔性状的分子标记选择方法，其特征在于，包括下列步骤1)以山羊基因组DNA为模板，在Taq DNA聚合酶、缓冲环境、Mg2+、dNTPs存在的情况下，利用引物P1和P2在PCR条件下进行扩增，筛查山羊KITL基因内含子1和6的碱基突变；所述的引物P1如下上游引物1F5′ TTCCTATGAGGTTACCAATG 3′；下游引物1R5' GTAGGCTAAACCTTGTCTTGT 3'。所述的引物P2如下上游引物2F5′ AGAGTTCACAAGACAAGGTT 3′；下游引物2R5' ATTAGGTTACTGGCGTTATG 3'；所述的PCR扩增的条件是15μL反应体系，包括10μmol/L的引物P1、P2的上下游引物各0.6 μL；2×Reaction Mix 5.825 μL；DNA Polymerase 0.125μL(2.5 U/μL)；50 ng/μL DNA 模板0.6 μL；超纯水7.25 μL。所述的PCR扩增反应程序如下利用引物P1的PCR扩增反应程序为95℃预变性5 min，94℃变性30s，49.6℃退火40s，72℃延伸40s，共进行36个循环，最后72℃充分延伸10min，4℃保存；利用引物P2的PCR扩增反应程序为95℃预变性5 min，...
【专利技术属性】
技术研发人员：曹斌云，安小鹏，侯金星，王建刚，宋宇轩，杨明明，朱广琴，王韵斐，崔易虹，陈秋菊，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：87
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