一种罗丹明６Ｇ的免疫亲合层析柱及其制备方法和用途技术

本发明专利技术公开了一种直接检测罗丹明６Ｇ免疫亲合层析柱。本发明专利技术所提供的免疫亲合层析柱用来提取和检测食品中的违禁添加剂罗丹明６Ｇ，包括罗丹明６Ｇ的特异性抗体、偶联有罗丹明６Ｇ特异性抗体Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ、装载亲和材料的塑料柱、氧化铝柱，上样缓冲液、淋洗液及洗脱液。本发明专利技术的罗丹明６Ｇ免疫亲合层析柱使用方便，具有高特异性、高灵敏性，可快速检测食品中残留的罗丹明６Ｇ。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于食品安全领域中违禁添加剂检测分析
具体而言，本专利技术涉 及一种罗丹明6G免疫亲合层析柱其制备方法及其用途。
技术介绍
罗丹明是一系列邻苯二酚类的工业和生物染料，并具有较强的荧光，有罗丹明B、 罗丹明6G、罗丹明110等十几种产品。罗丹明6G (Rhodamine 6G)，别名玫瑰红6G，对于人体及其他生物的毒性较大。通 过与皮肤、黏膜的接触，吸入和经口而侵入人体。它与细胞原浆中蛋白质接触时发生化学反 应，而使细胞失去活力，浓酚液能使蛋白质凝固。作用于蛋白质时，并不与之结合(此点与 强酸、强碱不同)，所以能继续向深部组织渗透，引起深部组织损伤坏死，并被吸收而引起全 身中毒。吸入高浓度的酚蒸气，可引起中枢神经系统障碍，经常暴露在酚浓度较低的空气 中，也能引起皮炎，能使皮肤变黄褐色。现场快速检测方法，也是使用非极性有机溶剂将其溶解并提取，提取液流过中性 氧化铝固相萃取小柱吸附罗丹明6G，用非极性有机溶剂淋洗小柱，洗脱样品油脂和食品内 源性干扰物，用肉眼可观测到在小柱上出现鲜亮的粉红色条带，判定为可疑样品。免疫亲和层析技术是一种将免疫反应和层析技术相结合的分析方法，在提纯物质 上是一项效率高、提纯物质纯度高、快速的技术，可以使免疫检测技术(如ELISA等)和层 析技术在特异性、分离能力、速度和灵敏度方面得到互补，避免了免疫分析法直接测定样品 的不足。免疫亲和柱是上个世纪90年代在分析领域中得到应用的技术，但用免疫亲和柱 串联氧化铝柱直接检测食品样品中的罗丹明尚未见报道。因此，本专利技术人通过大量试验，研 制成功了一种具有高特异性和灵敏度且操作快捷的直接检测罗丹明6G免疫亲合层析柱。
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种直接检测罗丹明6G的免疫亲合层析柱。本专利技术的原理是根据抗原抗体的特异性反应和可解离的特性，用罗丹明抗体提取 食品中的罗丹明6G残留，然后串联氧化铝柱，用其荧光直接检测罗丹明6G。一方面，本专利技术提供了一种制备罗丹明6G免疫亲合层析柱的方法，该方法包括下 列步骤a)将罗丹明6G特异性抗体与溴化氰活化的S印her0Se4B胶混合，转鼓搅拌，偶联 过夜；烧结玻璃滤器抽滤偶联胶，PBS洗脱未结合抗体，每次5毫升，洗4次；用IM乙醇胺 封闭未结合位点，加过量乙醇胺孵育2. 5小时，抽滤乙醇胺，用偶联缓冲液抽洗，然后再用 HAC, Tris-Hcl缓冲液交替洗涤共4次，每次5ml ；b)将偶联后的胶装入亲和层析塑料柱中，装注Iml/柱，稍用力压紧，即得所述的 罗丹明6G免疫亲合层析柱。在本专利技术的一个优选实施方案中，所述的罗丹明6G免疫亲合层析柱的制备方法具体操作为取Sepherose 4B (100-120 目)湿重 4g(6ml)，用 0. IM pH9. 5Na2C03 溶液浸泡 4 小 时。通风厨中称取溴化氰0. Sg溶于1. 2ml Na2CO3 (2g溶液3ml缓冲液)，电磁搅拌10分钟。 冰浴电磁搅拌下，将溴化氰溶液加入S印her0Se4B中，2分钟内完成，滴加2N NaOH,使pH值 保持在11，冰浴反应10分钟。将反应后的S印her0Se4B倒入布氏漏斗中，用预冷的Na2CO3溶液4-10V洗2-3分 钟内完成，抽洗25倍体积的液体准备交联蛋白。4°C下，将实施例1制备的抗体(多克隆或单克隆抗体)溶液与溴化氰活化的 Sepherose4B胶混合，转鼓搅拌，偶联反应过夜。烧结玻璃滤器抽滤偶联胶，PBS洗脱未结合抗体，每次5毫升，洗4次。分别测定 抗体含量。用IM乙醇胺(ethanolamine)封闭未结合位点，加过量乙醇胺孵育2. 5小时。抽 滤乙醇胺，用偶联缓冲液抽洗。然后再用交替的HAC，Tris-Hcl缓冲液洗4次，每次5ml。最后，将偶联后的胶装入亲和层析塑料柱中，装注Iml/柱，稍用力压紧，即得到本 专利技术所述的罗丹明6G免疫亲合柱。另一方面，本专利技术提供了一种罗丹明6G免疫亲合层析柱，该免疫亲合层析柱包括 偶联有罗丹明6G特异性抗体的S印har0Se4B与装载该亲和材料的塑料柱，以及与此亲和材 料塑料柱串联的氧化铝柱。其中所述的罗丹明6G特异性抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。本专利技术所述的罗 丹明6G特异性抗体通过下述方法制备1)按小分子半抗原的偶联方法制备罗丹明6G与载 体蛋白偶联物；以及，2)用该偶联物作为免疫原免疫动物(例如，兔)，分离血清，纯化得到 多克隆抗体；或者3)免疫小鼠，通过杂交瘤技术获得单克隆抗体；4)用不同载体蛋白的偶 联物为包被原用于检测抗体质量。其中所述的载体蛋白包括但不限于，例如牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白、卵 清蛋白和钥孔铜兰蛋白(keyhole limpethemocyanin，KLH)。所述的罗丹明6G与载体蛋白 的偶联物采用重氮化法、戊二醛法、活性酯法或多元酸酐法与混合酸酐法联合方法偶联。本专利技术所述免疫亲和层析柱的保存条件为0. 01%硫柳汞钠的磷酸盐缓冲液 (PBS，0. 01mol/L, ρΗ7· 4)，4°C保存。另外，为方便现场应用，本专利技术所述免疫亲合柱还可以进一步包括上样缓冲液、淋 洗液及洗脱液。在本专利技术的一个优选实施方案中，所述的上样缓冲液为PBS(0. 02MPB-0. 05MNaCl, PH7. 2)，所述的淋洗液为 PBST(0. 02MPB-0. 05MNaCl_0. 2% Tween20, PH7. 2)；所述的亲合层 析柱洗脱液为甲醇ΛΜ乙酸(V/V为97/3)。另一方面，本专利技术提供了一种罗丹明6G免疫亲合层析柱的使用方法，该方法包 括a)取出4°C保存的免疫亲和柱及上样缓冲液、淋洗液及洗脱液，回至室温，用上样 缓冲液充分淋洗亲和柱，除去储存Buffer中含的蛋白和防腐剂；b)将处理好的待检样品用上样缓冲液稀释至所需体积，上样，上样液滴干后，淋洗 液淋洗柱体，弃去，吸耳球吹干柱内溶液；c)用洗脱液洗脱特异性结合的罗丹明6G。d)洗脱的罗丹明6G流过串联的氧化铝柱，通过荧光进行检测。本专利技术使用腊肠进行了回收率实验，结果表明罗丹明6G免疫亲合层析柱的回收 率在80% -110%之间，回收率达到了分析方法的回收率要求。因此，另一方面，本专利技术提供了所述罗丹明6G免疫亲合层析柱在提取腊肠等食品 中罗丹明6G残留的用途。一个具体实施方案中，所述的食品为腊肠。提供下述实施例是为了更好地进一步理解本专利技术，而决不对本专利技术的内容和保护 范围构成任何限制。实施例实施例1抗罗丹明6G多克隆抗体的制备1. 1罗丹明6G免疫原的制备称取罗丹明6G 50. Omg(约0. Immol)，溶解于4ml去离子水中，加入甲醇4ml，氢氧 化钾20mg在60°C水解4小时，用6M盐酸调pH至3. 0，乙酸乙酯萃取，吹干，0. IM pH 7. 4PBS 复溶，将罗丹明6G溶液逐滴加入到10ml、0. IM pH 7. 4冰冷载体蛋白PB溶液中，随后加入 EDC IOOmg0载体用量BSA :50mg，KLH :50mg。偶联物过S印hadexG_25M层析柱提纯。用紫 外吸收法测定载体浓度作为偶联物浓度。提纯的偶联物加等量甘油-20°C保存。1. 2抗罗丹明6G多克隆抗体的制备选择健康、无病、雄性、体重2. 5kg纯种新西兰白兔5只。首免用注本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备罗丹明６Ｇ免疫亲合层析柱的方法，该方法包括下列步骤：　　ａ）将罗丹明６Ｇ特异性抗体与溴化氰活化的Ｓｅｐｈｅｒｏｓｅ４Ｂ胶混合，用转鼓搅拌，偶联过夜；烧结玻璃滤器抽滤偶联胶，ＰＢＳ洗脱未结合抗体，每次５毫升，洗４次；用１Ｍ乙醇胺封闭未结合位点，加过量乙醇胺孵育２．５小时，抽滤乙醇胺，用偶联缓冲液抽洗，然后再用ＨＡＣ，Ｔｒｉｓ－Ｈｃｌ缓冲液交替洗涤共４次，每次５ｍｌ；　　ｂ）将偶联后的胶装入塑料柱中，装注１ｍｌ／柱，稍用力压紧，即得所述的罗丹明６Ｇ免疫亲合层析柱。　　ｃ）将所制备的罗丹明６Ｇ免疫亲合层析柱与氧化铝柱串联，及得直接检测罗丹明６Ｇ的免疫亲合层析柱。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：杨曙明，于洪侠，邱静，陈刚，陈爱亮，张妍，邓省亮，张薇薇，
申请(专利权)人：中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]