【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于微生物制药领域，特别涉及一种高产纽莫康定b0的洛索亚棘白菌诱变菌株和应用。
技术介绍
1、纽莫康定b0(pneumocandin b0)又名肺念菌素b0、肺囊康定b0，是由丝状真菌洛索亚棘白菌glarea lozoyensis发酵产生的一种新型环脂肽类抗生素，属棘白菌素类化合物。纽莫康定b0的半合成衍生物卡泊芬净是全球第一个获准用于治疗侵袭性真菌感染的棘白菌素类药物，通过抑制真菌细胞壁主要成分1,3-β-d葡聚糖的合成而发挥杀菌作用，目前已成为各国临床指南推荐的抗真菌感染一线用药，在全球广泛上市销售。纽莫康定b0作为目前合成卡泊芬净的唯一前体，卡泊芬净的合成依赖于高质量纽莫康定b0的生产。但纽莫康定b0由glarea lozoyensis产生的nrps-pks杂合酶系统通过复杂的代谢网络合成，结构相对复杂，采用化学法合成难度极大且不具备工业应用价值。因此纽莫康定b0的发酵合成是制备卡泊芬净的一个重要瓶颈，其发酵效价的高低直接影响到卡泊芬净的生产成本和市场前景。
2、优质高产菌种选育与发酵工艺优化是提高纽莫康定b0发酵效价的主要手段，通过二十多年来国内外学者的不断研究积累，纽莫康定b0的发酵效价和产品质量得到显著提高，促进了卡泊芬净的推广应用。近年来纽莫康定b0产生菌的全基因组测序已经完成，菌种分子遗传改造方面也初有成效，但纽莫康定b0完整的生物合成途径与调控机制尚未完全阐明，可供改造的关键基因位点有限。传统诱变育种仍是获得纽莫康b0产高产菌株不可替代的有效手段，在菌株综合发酵性能改良时更能发挥出优势。中
3、在合成同一效价水平纽莫康定b0的情况下，发酵周期越长，能耗增大且设备利用率降低，导致生产成本偏高、染菌率增加。因此筛选发酵效价高、发酵周期短的纽莫康定b0生产菌株是一项极其重要的工作，目前以同时提高纽莫康定b0产量和缩短发酵周期为目的诱变育种报道很少。选育出高产纽莫康定b0且发酵周期短的菌株，对卡泊芬净的生产应用具有重要意义。
技术实现思路
1、鉴于现有技术的不足，本专利技术提供一种纽莫康定b0发酵效价高且发酵周期短的高产纽莫康定b0的洛索亚棘白菌诱变菌株和应用。
2、本专利技术的一方面，提供一种高产纽莫康定b0的洛索亚棘白菌诱变菌株，其为洛索亚棘白菌(glarea lozoyensis)a80pl9菌株，该菌株已于2023年7月17藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心(简称cctcc，地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，邮编：430072)，保藏编号cctcc no:m20231320。该菌株是以大邦(湖南)生物制药有限公司保藏的山梨醇偏好型纽莫康定b0工业生产菌株洛索亚棘白菌(glarea lozoyensis)tg178为出发菌株经artp-ems复合诱变选育得到。与出发菌株相比，a80pl9突变株纽莫康定b0罐上发酵效价可达6.73g/l，总发酵周期缩短至13天，且连续传代具有很好的遗传稳定性，是一株不可多得的生产纽莫康定b0高产优质菌株。
3、本专利技术的另一方面，提供前述高产纽莫康定b0的洛索亚棘白菌诱变菌株在用于发酵生产纽莫康定b0或提高纽莫康定b0的发酵产量中的应用。
4、本专利技术的另一方面，提供前述高产纽莫康定b0的洛索亚棘白菌诱变菌株的培养物或其培养物的萃取物。
5、本专利技术的另一方面，提供前述高产纽莫康定b0的洛索亚棘白菌诱变菌株的培养物或其培养物的萃取物在以纽莫康定b0为前体的纽莫康定b0的衍生物的合成中的应用；优选地，该纽莫康定b0的衍生物为卡泊芬净。
6、本专利技术的另一方面，提供一种菌剂，其包含前述高产纽莫康定b0的洛索亚棘白菌诱变菌株、或高产纽莫康定b0的洛索亚棘白菌诱变菌株的培养物或其培养物的萃取物中的任意一种。
7、前述高产纽莫康定b0的洛索亚棘白菌诱变菌株的选育方法，是利用常压室温等离子体(artp)和甲基磺酸乙酯(ems)进行复合诱变，通过初筛、复筛和稳定性验证，最终选育出一株纽莫康定b0发酵效价提高且发酵周期缩短的稳定突变株洛索亚棘白菌a80pl9，具体地，该选育方法包括：
8、s1、孢子悬液制备：将纽莫康定b0出发菌株glarea lozoyensis tg178接种于固体斜面孢子培养基斜面上，25℃下恒温培养10～12天，斜面培养孢子成熟后，用接种铲挖取菌块至盛有50ml无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶中，剧烈震荡打散，用四层灭菌擦镜纸过滤制成待诱变孢子悬液，使用真菌孢子计数仪并用生理盐水释至浓度107～108cfu/ml。
9、s2、artp-ems复合诱变：取10μl孢子悬液均匀涂布在置于培养皿中的无菌金属载片上，将培养皿转移至提前灭菌的artp诱变系统操作仓中，将金属载片放于操作仓旋转台上的对应孔位并旋转至等离子体发生器正下方。设置工作电压110w、照射距离2mm、工作气流10slpm(标准公升每分钟)、诱变时间120s。将诱变后的金属载片放入装有1ml无菌水的ep管中，震荡处理，使金属载片上的孢子液得以重悬，然后置于30℃恒温摇床孵化30min。孵化后加入装有9ml磷酸盐缓冲液的三角瓶中，再加入0.1ml甲基磺酸乙酯(ems)原液，使ems终浓度为1％，30℃恒温震荡90min后加入25％的硫代硫酸钠溶液5ml终止诱变，梯度稀释后涂布于固体平板孢子培养基上，25℃培养10～12天至能观测到单菌落。进行十次artp-ems复合诱变操作，构建大型突变文库。
10、s3、抑菌圈初筛：对复合诱变后的突变株，在不同时间观察平板培养基上单菌落的生长情况并进行计数。将诱变后菌落形态和颜色变化明显的单菌落同步接种至平板孢子培养基和含有发酵培养基的24深孔板中(孔板本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种高产纽莫康定B0的洛索亚棘白菌诱变菌株，其特征在于，所述菌株为洛索亚棘白菌(Glarea lozoyensis)A80PL9，于2023年7月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO:M20231320。
2.权利要求1所述高产纽莫康定B0的洛索亚棘白菌诱变菌株在用于发酵生产纽莫康定B0或提高纽莫康定B0的发酵产量中的应用。
3.权利要求1所述高产纽莫康定B0的洛索亚棘白菌诱变菌株的培养物或其培养物的萃取物。
4.权利要求3所述高产纽莫康定B0的洛索亚棘白菌诱变菌株的培养物或其培养物的萃取物在以纽莫康定B0为前体的纽莫康定B0的衍生物的合成中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述纽莫康定B0的衍生物为卡泊芬净。
6.一种菌剂，其特征在于，其包含权利要求1所述高产纽莫康定B0的洛索亚棘白菌诱变菌株、或权利要求3所述高产纽莫康定B0的洛索亚棘白菌诱变菌株的培养物或其培养物的萃取物中的任意一种。
7.一种纽莫康定B0的制备方法，其特征在于，通过培养权利要求1所述高产纽
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，培养至第7天开始每天补加浓度为20％的山梨醇水溶液，补加山梨醇水溶液的体积为初始发酵液体积的5％。
10.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述斜面孢子培养基包括以下浓度的各组分：葡萄糖5.0％、酵母提取物1.0％、麦芽提取物0.5％、大豆蛋白胨0.5％、水解酪蛋白0.1％、硫酸铵0.1％、琼脂2.0％，其余为蒸馏水；灭菌前调节pH至6.5，灭菌条件为121℃、30min；
...【技术特征摘要】
1.一种高产纽莫康定b0的洛索亚棘白菌诱变菌株，其特征在于，所述菌株为洛索亚棘白菌(glarea lozoyensis)a80pl9，于2023年7月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏号为cctcc no:m20231320。
2.权利要求1所述高产纽莫康定b0的洛索亚棘白菌诱变菌株在用于发酵生产纽莫康定b0或提高纽莫康定b0的发酵产量中的应用。
3.权利要求1所述高产纽莫康定b0的洛索亚棘白菌诱变菌株的培养物或其培养物的萃取物。
4.权利要求3所述高产纽莫康定b0的洛索亚棘白菌诱变菌株的培养物或其培养物的萃取物在以纽莫康定b0为前体的纽莫康定b0的衍生物的合成中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述纽莫康定b0的衍生物为卡泊芬净。
6.一种菌剂，其特征在于，其包含权利要求1所述高产纽莫康定b0...
【专利技术属性】
技术研发人员：李辉，宁雅芳，邓志强，陈伟清，胥龙奇，许行健，郭霞凌，
申请(专利权)人：大邦湖南生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：
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