本发明专利技术公开了一种参与利普斯他汀及其结构类似物合成的基因簇及其应用，该基因簇共包括bkdA2，bkdB2，bkdC2三个结构基因以及一个bkdR转录调控基因。敲除毒三素链霉菌中所述基因簇任意一个或多个基因，可显著提高结构类似物RRT0.90的发酵水平。增强转录调控基因bkdR的表达，则可有效提高利普斯他汀的发酵效价。本发明专利技术为深入研究利普斯他汀及其结构类物的生物合成机理提供了直接依据，为开发更有效的奥利司他衍生物奠定了基础。本发明专利技术构建的利普斯他汀工程菌株能直接应用于奥利司他的发酵生产，可降低生产成本，提高经济效益。提高经济效益。提高经济效益。
【技术实现步骤摘要】
一种参与利普斯他汀及其结构类似物合成的基因簇及其应用
[0001]本专利技术属于工业微生物基因资源挖掘与遗传育种领域，具体涉及毒三素链霉中与利普斯他汀及其结构类似物合成有关的支链α酮酸脱氢酶复合物编码基因簇及其应用。
技术介绍
[0002]利普斯他汀是由毒三素链霉菌(Streptomyces toxytricini)发酵产生的一种特异性肠胃道脂肪酶抑制剂，其分子结构中含有两个脂肪酸长链、一个反式中心β内酯环和一个氨基酸侧链。利普斯他汀的氢化还原产物奥利司他化学性质更加稳定，由罗氏公司开发成体重控制药物于1999年获批上市，至今已有超过20年的安全有效使用历史，是目前全球唯一的OTC减重药和非中枢神经作用减重药，也是唯一可用于12岁以上青少年肥胖症治疗的减重药。
[0003]利普斯他汀作为微生物次级代谢产物，在发酵过程中会产生一些与其结构和理化性质相近的结构类似物，现已报道的大多数利普斯他汀结构类似物均具有相同的天然β内酯骨架结构，仅在脂肪酸长链上有所不同，主要表现在其两条长链脂肪酸中含有一条末端单甲基化的异式或反异式脂肪酸，甲基位于脂肪酸分子碳链骨架倒数第2个或第3个碳原子上，形成脂肪酸支链。本专利技术的申请人在前期研究中发现并鉴定了一种结构新颖的利普斯他汀结构类似物RRT0.90(HPLC图谱中与利普斯他汀的相对保留时间为0.90)，与利普斯他汀具有相同的β内酯骨架和脂肪酸长链，唯一不同点为两种化合物骨架上酯键连接的氨基酸不同，其中利普斯他汀为甲酰化亮氨酸，RRT0.90则为甲酰化苯丙氨酸。
[0004][0005]含有β内酯结构的天然产物比较少见且具有良好的生物活性，按来源不同可分为萜类β内酯、脂肪酸和聚酮类β内酯、α
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氨基
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β内酯三类。脂肪酸和聚酮类β内酯化合物具有良好的脂肪酶抑制活性，利普斯他汀作为其典型代表已被开发成药。但利普斯他汀结构类似物在毒三素链霉菌发酵液中的含量极低，难以提取和制备，大大限制了对其深入研究和开发应用。利普斯他汀的生物合成已有大量的研究，但其完整的生物合成途径仍未完全阐明，有关利普斯他汀结构类似物的形成机制研究报道很少，而有关其结构类似物RRT0.90的形成机制未见任何报道。
技术实现思路
[0006]本专利技术为克服现有技术的不足，以利普斯他汀发酵过程中产生的RRT0.90结构类似物为目标分子，对利普斯他汀产生菌进行了全基因组测序、基因组再分析和代谢网络重构，在染色体上发现了并鉴定了与利普斯他汀及其结构类似物RRT0.90形成有关的支链α酮酸脱氢酶编码基因簇bkdA2B2C2。所述基因簇包含bkdA2，bkdB2和bkdC2三个结构基因和一
ID No.4所示，其编码的蛋白质氨基酸序列如SEQ ID No.8所示。
[0020]本专利技术所述的提升利普斯他汀发酵效价的工程菌株构建方法，包括如下步骤：
[0021]1)整合型表达载体构建：以毒三素链霉菌基因组DNA为模板，通过PCR扩增得到所述转录调控基因片段，通过酶切酶连的方法连入整合型质粒pIB139的NdeI/XbaI位点，得到整合型表达质粒pIB139
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bkdR，pIB139
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bkdR包含有红霉素抗性基因强启动子PermE*以及完整的bkdR基因，还含有质粒转移所需原件和及噬菌体的整合酶和整合位点。
[0022]2)接合转移与强化表达菌株筛选：将所述整合型表达质粒转化大肠杆菌ET12567(pUZ8002)，通过属间接合转移导入毒三素链霉菌，通过安普霉素抗性筛选整个pIB139
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bkdR载体特异性整合进入毒三素链霉菌染色体的重组强化表达菌株。
[0023]所述的转录调控基因为前述的bkdR基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，其编码的蛋白质氨基酸序列如SEQ ID No.8所示。
[0024]本专利技术所述基因簇的应用，是指通过对所述基因簇中的任意一个、任意两个、任意三个或全部四个基因进行敲除构建得到的工程菌，以及对所述基因簇中的转录调控基因进行强化表达构建的工程菌，在适用于利普斯他汀产生的条件下进行发酵培养，用于生产或制备利普斯他汀或其结构类似物RRT0.90。将工程菌依次经摇瓶种子培养、种子扩大培养和发酵培养基培养后生产或制备利普斯他汀或其结构类似物RRT0.90，发酵产物经分离纯化后可进一步合成奥利司他或其衍生物。包括含有SEQ ID No.1
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4的任意核苷酸序列的基因和或含有选自SEQ IDNo.4
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8的任意氨基酸序列的多肽均适用于生产或制备利普斯他汀或结构类似物RRT0.90。
[0025]有益效果：本专利技术在毒三素链霉菌染色体上鉴定了与利普斯他汀及其结构类似物RRT0.90合成有关的基因簇bkdA2B2C2。通过对基因簇bkdA2B2C2中的bkdA2，bkdB2，bkdC2和bkdR中的至少一个进行失活，可显著提升利普斯他汀结构类似物RRT0.90的发酵水平，为制备新的利普斯他汀衍生物的研究奠定基础。通过对基因簇bkdA2B2C2中的转录调控基因bkdR强化表达，可有效提高利普斯他汀的发酵效价，降低生产成本。
附图说明
[0026]图1为毒三素链霉菌中支链α酮酸脱氢酶复合物编码基因簇示意图；
[0027]图2为目的基因敲除的同源重组模型示意图；
[0028]图3为bkdR基因强化表达载体构建示意图；
[0029]图4为出发菌株AP617
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N12CA的发酵产物分离纯化后的HPLC检测图；
[0030]图5为bkdR单基因敲除工程菌发酵产物分离纯化后的HPLC检测图；
[0031]图6为bkdC2
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bkdB2
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bkdA2三基因敲除工程菌发酵产物分离纯化后的HPLC检测图；
[0032]图7为bkdR单基因敲除工程菌利普斯他汀加氢产物的质谱图；
[0033]图8为bkdR单基因敲除工程菌利普斯他汀结构类似物RR0.90加氢产物的质谱图。
具体实施方式
[0034]为使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合具体实施方式和实施例对本
技术实现思路
进行详细说明，但本专利技术的范围不限于此。以下具体实施例中，如无特别说明，使用的仪器是和试剂本领域常用的仪器和试剂，可以通过公开的市受渠道获得；所使
用的方法为本领域技术人员熟知的常规方法，本领域技术人员根据实施例内容可以知道如何具体实现所述方法。
[0035]以下实施例中所涉及的几种大肠杆菌和放线菌穿梭质粒均为本领域技术人员公知菌株和质粒，其中穿梭质粒pKC1139、链霉菌噬菌体的衍生质粒pIB139及大肠杆菌ET12567(pUZ8002)由申请人大邦(湖南)生物制药有限公司研发中心保藏，毒三素链霉AP617
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N12CA为申请人大邦(湖南)生物制药有限公司的工业生产菌株，记载在本申请人公开发表的文献[李辉，方志锴，郭本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种参与利普斯他汀及其结构类似物合成的基因簇，其特征在于，所述基因簇由bkdA2、bkdB2、bkdC2和bkdR四个基因组成；所述基因bkdA2的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述基因bkdB2的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；所述基因bkdC2的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；所述基因bkdR的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；所述利普斯他汀结构类似物的结构如下所示：2.根据权利要求1所述的基因簇，其特征进一步在于，所述基因bkdA2的核苷酸序列编码的蛋白质氨基酸序列如SEQ ID No.5所示；所述基因bkdB2的核苷酸序列编码的蛋白质氨基酸序列如SEQ ID No.6所示；所述基因bkdC2的核苷酸序列编码的蛋白质氨基酸序列如SEQ ID No.7所示；所述基因bkdR的核苷酸序列编码的蛋白质氨基酸序列如SEQ ID No.8所示。3.一种工程菌，其特征在于，以毒三素链霉菌Streptomyces toxytricini为出发菌株，对如权利要求1所述的基因簇中的bkdA2、bkdB2、bkdC2和bkdR基因中的任意一个、任意两个、任意三个或全部四个基因进行敲除得到。4.一种工程菌，其特征在于，以毒三素链霉菌Streptomyces toxytricini为出发菌株，对如权利要求1所述的基因簇中的bkdR基因进行过量表达得到。5.如权利要求3或权利要求4所述的工程菌，其特征进一步在于，所述毒三素链霉菌Streptomyces toxytricini包括毒三素链霉菌AP617
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N12CA。6.一种权利要求3所述的工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)以毒三素链霉菌基因组DNA为模板，通过PCR扩增获得目的基因的同源重组左臂片段和右臂片段，将左臂片段和右臂片段插入到质粒多克隆位点上，获得目的基因敲除质粒；所述目的基因是bkdA2B2C2基因簇中的...
【专利技术属性】
技术研发人员：李辉，彭滢，李剑，刘彤，胥龙奇，邓志强，方志锴，
申请(专利权)人：大邦湖南生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：
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