本发明专利技术提供苦荞细胞色素P450酶FtCYP94C1及其编码基因和应用，属于基因工程技术领域。所述的编码基因为FtCYP94C1基因SEQ ID NO.1，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO.2。本发明专利技术通过构建过表达FtCYP94C1基因的植株，验证了FtCYP94C1基因能够抗立枯丝核菌侵染，为解决植物立枯病问题提供了新的技术方案，具有较好的实用前景。的实用前景。的实用前景。
【技术实现步骤摘要】
苦荞细胞色素P450酶FtCYP94C1及其编码基因和应用
[0001]本专利技术属于基因工程
，具体涉及FtCYP94C1基因及其在抗立枯病中的应用。
技术介绍
[0002]鞑靼荞麦(Fagopyrum tataricum)也称苦荞麦、苦荞，是一种营养均衡的无麸质作物，富含生物活性黄酮，在亚洲和欧洲被广泛种植。苦荞所含有的芦丁作为一种抗氧化剂，能够降低胆固醇、血栓、高血压以及增强血管韧性。由土壤传播的植物病原体立枯丝核菌(Rhizoctonia solani，R.solani)引起的荞麦茎腐病是荞麦最具破坏性的病害之一，其导致荞麦幼苗死亡，使荞麦产量受到严重损失。立枯丝核菌是一种侵染性坏死性病原体，可以感染250多种植物，包括单子叶植物和双子叶植物。目前防治立枯病的传统方法是化学药物喷施，以抑制致病菌的生长，然而长期使用将导致土壤微生物种群减少，土壤板结，肥力下降，后期修复难度增加，也会带来农药残留和致病菌抗药性产生等问题。抗性种质资源的筛选和优异基因挖掘是抗病育种的关键，而荞麦在立枯病抗性育种方面的研究鲜有报道。
[0003]在复杂的胁迫环境下，植物发展了各种防御策略来保护自己免受病原体的感染。植物激素茉莉酸(jasmonic acid,JA)是一种化学物质，在激活植物对病原体攻击的防御中起着关键作用。为了协调生长和对病原体或食草动物的防御，植物在应对这些压力时合成茉莉酸，促进JA
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Ile(茉莉酸与异亮氨酸的衍生物)的合成并诱导植物防御相关基因表达。现有技术中尚未有JA诱导的苦荞中的相关抗立枯病基因的公开。细胞色素P450(CYP450)是植物体内一类超基因家族编码的单加氧酶，能够参与多种催化反应，在生物防御响应中发挥重要重要作用。在本研究中通过基因克隆获得了一个重要的JA信号转导基因FtCYP94C1，其编码一种负责将JA
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Ile氧化成12OH
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JA
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Ile的酶，对其立枯病抗性功能进行了较系统的探究，填补了苦荞中细胞色素P450酶在抗立枯病功能中的研究空白。
技术实现思路
[0004]本专利技术旨在克隆一个FtCYP94C1基因，并探究其在抗植物立枯病中的应用。本专利技术发现苦荞的一个基因FtCYP94C1与拟南芥CYP94C1同源，在抵抗R.solani方面起到积极作用。过量表达FtCYP94C1增强了植株的抗病性，且FtCYP94C1拟南芥中黄酮类代谢物的含量高于野生型。因此，这些结果表明，FtCYP94C1在苦荞对立枯丝核菌的抗性中是一个积极的调节因子。
[0005]一方面，本专利技术提供了一种FtCYP94C1基因。
[0006]所述的基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO.2。
[0007]所述的基因用于编码苦荞细胞色素P450酶FtCYP94C1。
[0008]本专利技术同时提供了包含FtCYP94C1基因的表达载体和包含前述表达载体的基因工程细胞。
[0009]另一方面，本专利技术提供了FtCYP94C1基因在抗立枯丝核菌感染中的应用。
[0010]优选地，所述的应用为抗立枯病。
[0011]优选地，所述的应用对象为植物。
[0012]进一步优选地，所述的应用对象为荞麦属植物。
[0013]更进一步地，所述的应用对象为苦荞。
[0014]具体地，所述的应用可以是荞麦属植物的育种，优选为苦荞育种。
[0015]再一方面，本专利技术提供了FtCYP94C1基因或表达FtCYP94C1基因的载体或表达FtCYP94C1基因的细胞在构建转基因植物中的应用。
[0016]具体地，所述的植物过表达FtCYP94C1基因。
[0017]具体地，所述的转基因植物具有立枯病抗性。
[0018]又一方面，本专利技术提供了一种转基因植株的构建方法。
[0019]所述的构建方法中包括在植物中过表达FtCYP94C1基因。
[0020]优选地，所述的构建方法中包括将FtCYP94C1基因插入表达空载体，转化宿主细胞后侵染植物获得转基因植株。
[0021]优选地，所述的表达空载体为植物表达载体，进一步优选地，所述的表达空载体为pCAMBIA 1302。
[0022]优选地，所述的宿主细胞为具有表达功能的基因工程细胞，优选为农杆菌，进一步优选为农杆菌GV3101。
[0023]优选地，所述的宿主细胞为大肠杆菌BL21，进一步优选为大肠杆菌BL21(DE3)。
[0024]优选地，所述的构建方法包括以下步骤：
[0025](1)克隆获得转录因子FtCYP94C1基因；
[0026](2)将FtCYP94C1基因可操作性地构建于表达调控序列，形成含FtCYP94C1基因的植物表达载体；
[0027](3)将步骤(2)所得的含FtCYP94C1基因的植物表达载体转化农杆菌GV3101，获得用于转化的含FtCYP94C1基因农杆菌菌株；
[0028](4)并利用步骤(3)所构建的农杆菌菌株遗传转化目的植物。
[0029]优选地，所述的目的植物为苦荞。
[0030]优选地，所述的克隆FtCYP94C1基因的方法为PCR。
[0031]优选地，所述的PCR引物为1302
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FtCYP94C1 F/R，序列为SEQ ID NO.5
‑
6。
[0032]优选地，所述的PCR的运行程序为95℃3min；95℃30s，58℃30s，72℃90s，31个循环。
[0033]在一些实施例中，所述的构建方法包括以下步骤：
[0034](1)克隆获得转录因子FtCYP94C1基因；
[0035](2)将FtCYP94C1基因可操作性地构建于表达调控序列，形成含FtCYP94C1基因的植物表达载体；
[0036](3)将步骤(2)所得的含FtCYP94C1基因的植物表达载体转化农杆菌GV3101，获得用于转化苦荞的含FtCYP94C1基因农杆菌菌株；
[0037](4)并利用步骤(3)所构建的农杆菌菌株遗传转化拟南芥。
[0038]在一些实施例中，所述的构建方法包括以下步骤(1)为：用1％次氯酸钠溶液消毒10min和75％乙醇灭菌2min再用无菌水清洗直至水呈澄清为止，对苦荞种子进行消毒，利用
MS培养基培养获得苦荞无菌苗。
[0039]所述的无菌苗是指将种子放在灭菌的滤纸上吸干水分，种植在MS培养基上；培养条件是温度为22
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25℃，光周期为16h/8h，湿度为75％
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80％，培养2
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4周。
[0040]本专利技术的有益效果：
[0041]本专利技术克隆了一个FtCYP94C1基因，探究了其在苦荞抗立枯病中的作用；并且利用基因工程手段，将FtCYP94C1基因遗传转化拟南芥获得过表达的本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.FtCYP94C1基因在抗立枯丝核菌感染中的应用，其特征在于，所述的基因为SEQ ID NO.1，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO.2。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的应用为抗立枯病。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的应用对象为植物。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的应用对象为荞麦属植物。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的应用对象为苦荞。6.FtCYP94C1基因或表达FtCYP94C1基因的载体或表达FtCYP94C1基因的细胞在构建转基因植物中的应用。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的转基因植物过表达FtCYP94C1基因。8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的转基因植物具有立枯病抗性。9.一种转基因植株的构建方法，其特征在于，包括在植物中过表达FtCYP94C1基因。10.根据权利要求...
【专利技术属性】
技术研发人员：周美亮，关超男，卢翔，张凯旋，何毓琦，李光胜，
申请(专利权)人：三亚中国农业科学院国家南繁研究院，
类型：发明
国别省市：
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