重组吡喃糖氧化酶及其制备方法和应用技术

本申请公开了一种重组吡喃糖氧化酶及其制备方法和应用。本申请中，编码吡喃糖氧化酶的分离的多核苷酸经密码子优化，且所述多核苷酸选自以下任一种：(i)具有如SEQ ID NO.1所示序列的多核苷酸；(ii)具有与如SEQ ID NO.1所示序列的同源性大于95％的多核苷酸；和(iii)具有与(i)或(ii)中所述的多核苷酸序列互补的多核苷酸。本发明专利技术通过密码子优化核酸序列，使得其适应大肠杆菌表达系统，生产周期短、产量高且产物活性高，本发明专利技术还通过可溶性标签的配合，使得产物可溶性好，易于分离纯化。易于分离纯化。易于分离纯化。

【技术实现步骤摘要】
重组吡喃糖氧化酶及其制备方法和应用


[0001]本专利技术及生物
，特别涉及重组吡喃糖氧化酶及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]吡喃糖氧化酶(Pyranose Oxidase或简称PROD)是由担子菌纲的微生物产生的一类葡萄糖2位氧化酶，在以D
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葡萄糖为底物，分子氧作为电子受体时呈现最高活性。它的分子量为70kD，是已知酶中较大的含黄素蛋白的酶，由623个氨基酸残基构成，目前在生物分子、食品或饮料行业、疾病诊断、生物过程监测和环境污染物筛选等方面都有应用(B.Perez
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Lopez,A.Merkoci,Nanoparticles for the development of improved(bio)sensing systems,Anal.Bioanal.Chem.399(2011)1577
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1590)，其中，PROD作为生物传感器主要是基于其有效氧化各种碳水化合物的能力(S.Timur,Y.Yigzaw,L.Gorton,Electrical wiring of pyranose oxidase with osmium redox polymers,Sens.Actuator.B Chem.113(2006)684
–
691)。PROD是葡萄糖
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甲醇
‑
胆碱(GMC)氧化还原酶超家族中的一种非黄酮氧化还原酶(L.S
ü
tzl,C.Laurent,A.T.Abrera,G.Sch
ü
tz,R.Ludwig,D.Haltrich,Multiplicity of enzymatic functions in the CAZy AA3 family,Appl.Microbiol.Biotechnol.102(2018)2477
–
2492)，通常在木材降解真菌中发现，它在细胞外与菌丝胞质周围空间的膜结合囊泡或其他膜结构相结合(G.Daniel,J.Volc,E.Kub
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tov
á
,T.Nilsson,Ultrastructural and immunocytochemical studies on the H2O2
‑
producing enzyme pyranose oxidase inPhanerochaete chrysosporiumgrown under liquid culture conditions,Appl.Environ.Microbiol.58(1992)3667
–
3676)。除真菌外，吡喃糖氧化酶还存在于放线菌纲、变形菌纲和杆菌类细菌中(P.L.Herzog,L.S
ü
tzl,B.Eisenhut,D.Maresch,D.Haltrich,C.Obinger,C.K.Peterbauer,Versatile oxidase and dehydrogenase activities of bacterial pyranose 2
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oxidase facilitate redox cycling with manganese peroxidase in vitro,Appl.Environ.Microbiol.85(2019))。系统发育研究表明，PROD是唯一一种真菌和细菌共享的GMC酶(L.S
ü
tzl,G.Foley,E.Gillam,M.Bod
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n,D.Haltrich,The GMC superfamily of oxidoreductases revisited:analysis and evolution of fungal GMC oxidoreductases,Biotechnol Biofuels 12(2019)118)。
[0003]传统方法主要是通过真菌类微生物的提取获得吡喃糖氧化酶，不仅来源受限制，而且存在产量低、纯化工艺繁杂等问题，难以得到高纯度蛋白。基因工程法构建PROD生产菌株，纯化工艺简单，来源不受限，是解决上述问题的有效办法。曾有研究者用大肠杆菌表达系统对吡喃糖氧化酶的表达进行了研究，由于淡黄褐栓菌的吡喃糖氧化酶在大肠杆菌中的表达属于异源性表达，产物中出现大量包涵体，吡喃糖氧化酶的活性也同时受到影响。
[0004]因此，开发一种生产周期短、产量高、产物活性高的吡喃糖氧化酶的制备方法十分重要。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种吡喃糖氧化酶的制备方法，使得制备吡喃糖氧化酶活性高、稳定性好、产率高、易于纯化、易于转发酵批量生产。
[0006]为解决上述技术问题，本专利技术第一方面提供了一种编码吡喃糖氧化酶的多核苷酸，所述多核苷酸经密码子优化，且所述多核苷酸选自以下任一种：
[0007](i)具有如SEQ ID NO.1所示序列的多核苷酸；
[0008](ii)具有与如SEQ ID NO.1所示序列的同源性大于95％的多核苷酸；和
[0009](iii)具有与(i)或(ii)中所述的多核苷酸序列互补的多核苷酸。
[0010]在一些优选的方案中，所述多核苷酸是分离的多核苷酸。
[0011]本专利技术第二方面提供了一种表达载体，所述表达载体包括本专利技术第一方面提供的的多核苷酸。
[0012]在一些优选的方案中，所述表达载体包括表达His
×
6标签的多核苷酸序列，更优选地，所述表达载体中，所述的多核苷酸的3
’
端连接有表达His
×
6标签的多核苷酸序列。
[0013]在一些优选的方案中，所述表达载体为大肠杆菌表达载体，更优选为pET
‑
28a(+)。
[0014]本专利技术第三方面提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包括本专利技术第二方面提供的表达载体；或者
[0015]所述宿主细胞的基因组中整合有如本专利技术第一方面提供的的多核苷酸。
[0016]在一些优选的方案中，所述宿主细胞为大肠杆菌。
[0017]本专利技术第四方面提供了一种制备吡喃糖氧化酶的方法，所述方法包括步骤：
[0018]培养本专利技术第三方面所述的宿主细胞，以表达出目的蛋白；和
[0019]分离所述目的蛋白，即得所述吡喃糖氧化酶；
[0020]其中，所述目的蛋白具有如氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
[0021]本专利技术第五方面提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括：如本专利技术第一方面提供的的多核苷酸；或者
[0022]如本专利技术第二方面提供的表达载体；或者
[0023]如本专利技术第三方面所述的宿主细胞；或者
[0024]或者根据本专利技术第四方面所述的方法制备的吡喃糖氧化酶。
[0025]本专利技术相对于现有技术而言，至少具有下述优点：
[0026](1)本专利技术提本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种编码吡喃糖氧化酶的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸经密码子优化，且所述多核苷酸选自以下任一种：(i)具有如SEQ ID NO.1所示序列的多核苷酸；(ii)具有与如SEQ ID NO.1所示序列的同源性大于95％的多核苷酸；和(iii)具有与(i)或(ii)中所述的多核苷酸序列互补的多核苷酸。2.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包括如权利要求1所述的多核苷酸。3.根据权利要求2所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体包括表达His
×
6标签的多核苷酸序列。优选地，所述表达载体中，如权利要求1所述的多核苷酸的3
’
端连接有表达His
×
6标签的多核苷酸序列。4.根据权利要求2所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为大肠杆菌表达载体，优选为pET
‑
28a(+)。5.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包括如权利要求2至4中任...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱伟伟，蒋析文，张伟，孟晓琳，连献兰，
申请(专利权)人：广州达安基因股份有限公司，
类型：发明
国别省市：