重组胆固醇氧化酶及其制备方法和应用技术

本申请公开了一种重组胆固醇氧化酶及其制备方法和应用。本申请中，编码胆固醇氧化酶的多核苷酸，经密码子优化，且所述多核苷酸选自以下任一种：(i)具有如SEQ ID NO.1所示序列的多核苷酸；(ii)具有与如SEQ ID NO.1所示序列的同源性大于95％的多核苷酸；和(iii)具有与(i)或(ii)中所述的多核苷酸序列互补的多核苷酸。本发明专利技术开发了基于基因工程的胆固醇氧化酶发酵体系，通过大量的密码子优化更适应大肠杆菌表达系统，制备效率大大提高，且得到的可溶性胆固醇氧化酶占比高，易于纯化和批量生产。产。产。

【技术实现步骤摘要】
重组胆固醇氧化酶及其制备方法和应用


[0001]本专利技术及生物
，特别涉及重组胆固醇氧化酶及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]胆固醇氧化酶(Cholesterol oxidase或简称为ChOx)是一种黄素蛋白的氧化还原酶，能催化胆固醇为胆甾
‑4‑
烯
‑3‑
酮和过氧化氢，是胆固醇代谢过程中的一个关键酶(Kreit J,Sampson N S.Cholesterol oxidase:physiological functions[J].Febs J,2010,276(23)：6844
‑
6856)，主要催化胆固醇碳3位置的脱氢，此外还是一个异构化酶，因此胆固醇氧化酶是一个双功能的酶(Lata Kumari，Shamsher Kanwar.Purification and characterization of an extracellular cholesterol oxidase of Bacillus subtilis isolated from tiger excreta[J].Applied Biochemistry and Biotechnology,2016,178(2)：353
‑
367)。它的分子量为30kD，编码504个氨基酸，在临床应用中，ChOx是一种有用的分析工具，已被用于生物催化生产许多类固醇，作为杀虫蛋白防治棉铃象甲幼虫，特别是作为测定血清胆固醇水平的诊断酶(Pollegioni L,Piubelli L,Molla G.Cholesterol oxidase:biotechnological applications.FEBS J.2009 Dec；276(23):6857
‑
70.Epub 2009 Oct 16.PMID:19843167)。在细菌中，ChOx是催化途径中第一个产生丙酸和乙酸酯作为最终产物的酶。并且，ChOx在哺乳动物中没有同源基因。胆固醇氧化酶(3b
‑
羟基类固醇氧化酶)催化作用的一个重要方面是它与含有固醇底物的脂质双分子层结合的性质。有效的催化周转受蛋白质与膜的结合以及底物在脂质双分子层中的溶解度的影响。
[0003]传统的胆固醇氧化酶生产方法有提取分离法、化学合成法和动植物细胞培养法。这些方法生产周期长，效率低，产物活性低。由于微生物具有多样性、繁殖快速、易发生遗传变异、胞外酶易分离纯化，且产生的蛋白质具有更宽的pH、反应温度范围和底物特异性的优势，十分适宜蛋白质的大量合成。因此，研发一种基于微生物发酵体系的稳定的，产率高的，易于纯化的胆固醇氧化酶的制备方法十分重要。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供一种胆固醇氧化酶的制备方法，使得制备胆固醇氧化酶稳定性好，产率更高，易于纯化、易于转发酵批量生产，成本更低。
[0005]为解决上述技术问题，本专利技术第一方面提供了一种编码胆固醇氧化酶的多核苷酸，所述多核苷酸经密码子优化，且所述多核苷酸选自以下任一种：
[0006](i)具有如SEQ ID NO.1所示序列的多核苷酸；
[0007](ii)具有与如SEQ ID NO.1所示序列的同源性大于95％的多核苷酸；和
[0008](iii)具有与(i)或(ii)中所述的多核苷酸序列互补的多核苷酸。
[0009]在一些优选的方案中，所述多核苷酸是分离的多核苷酸。
[0010]本专利技术第二方面提供了一种表达载体，所述表达载体包括本专利技术第一方面提供的的多核苷酸。
[0011]在一些优选的方案中，所述表达载体包括表达His
×
6标签的多核苷酸序列，更优选地，所述表达载体中，所述的多核苷酸的3
’
端连接有表达His
×
6标签的多核苷酸序列。
[0012]在一些优选的方案中，所述表达载体为大肠杆菌表达载体，更优选为pET
‑
28a(+)。
[0013]本专利技术第三方面提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包括本专利技术第二方面提供的表达载体；或者
[0014]所述宿主细胞的基因组中整合有如本专利技术第一方面提供的的多核苷酸。
[0015]在一些优选的方案中，所述宿主细胞为大肠杆菌。
[0016]本专利技术第四方面提供了一种制备胆固醇氧化酶的方法，所述方法包括步骤：
[0017]培养本专利技术第三方面所述的宿主细胞，以表达出目的蛋白；和
[0018]分离所述目的蛋白，即得所述胆固醇氧化酶；
[0019]其中，所述目的蛋白具有如氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
[0020]本专利技术第五方面提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括：如本专利技术第一方面提供的的多核苷酸；或者
[0021]如本专利技术第二方面提供的表达载体；或者
[0022]如本专利技术第三方面所述的宿主细胞；或者
[0023]或者根据本专利技术第四方面所述的方法制备的胆固醇氧化酶。
[0024]本专利技术相对于现有技术而言，至少具有下述优点：
[0025](1)本专利技术提供的方法，通过密码子优化序列，利用大肠杆菌表达系统成功表达出胆固醇氧化酶，该方法产量高，生长周期短，产物稳定性好；
[0026](2)本专利技术提供的方法采用了基因工程大肠杆菌重组融合表达胆固醇氧化酶，并实现了在大肠杆菌系统的可溶性表达蛋白的产量高，易于纯化，并具备催化活性，易于转发酵批量生产。
[0027]应理解，在本专利技术范围内中，本专利技术的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
[0028]一个或多个实施例通过与之对应的附图中的图片进行示例性说明，这些示例性说明并不构成对实施例的限定。
[0029]图1是根据本专利技术实施例中胆固醇氧化酶SDS
‑
PAGE鉴定结构图；
[0030]图2是根据本专利技术实施例中胆固醇氧化酶Ni柱纯化所得电泳图；
[0031]图3是根据本专利技术实施例中胆固醇氧化酶酶切透析后所得电泳图；
[0032]图4是根据本专利技术实施例中胆固醇氧化酶标准曲线图。
具体实施方式
[0033]现有技术中，胆固醇氧化酶的生产周期长，产物活性低。本专利技术开发了基于基因工程的胆固醇氧化酶发酵体系，通过大量的密码子优化更适应大肠杆菌表达系统，制备效率大大提高，且得到的可溶性胆固醇氧化酶占比高，易于纯化和批量生产。
[0034]本专利技术的一些实施方式中提供了一种编码胆固醇氧化酶的分离的多核苷酸，所述
多核苷酸经密码子优化，且所述多核苷酸选自以下任一种：
[0035](i)具有如SEQ ID NO.1所示序列的多核苷酸；
[0036](ii)具有与如SEQ ID NO.1所示序列的同源性大于95％的多核苷酸；和
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种编码胆固醇氧化酶的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸经密码子优化，且所述多核苷酸选自以下任一种：(i)具有如SEQ ID NO.1所示序列的多核苷酸；(ii)具有与如SEQ ID NO.1所示序列的同源性大于95％的多核苷酸；和(iii)具有与(i)或(ii)中所述的多核苷酸序列互补的多核苷酸。2.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包括如权利要求1所述的多核苷酸。3.根据权利要求2所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体包括表达His
×
6标签的多核苷酸序列。优选地，所述表达载体中，如权利要求1所述的多核苷酸的3
’
端连接有表达His
×
6标签的多核苷酸序列。4.根据权利要求2所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为大肠杆菌表达载体，优选为pET
‑
28a(+)。5.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包括如...

【专利技术属性】
技术研发人员：蒋析文，朱伟伟，张伟，孟晓琳，郑桑桑，
申请(专利权)人：广州达安基因股份有限公司，
类型：发明
国别省市：