中药注射剂微量蛋白检测方法技术

一种能够检测中药注射剂微量蛋白的检测方法，用于检测中药注射剂蛋白质类杂质，以控制中药注射剂的质量。其特征在于按以下步骤进行：１）先将中药注射剂样品点到蛋白质特异性吸附膜上；２）用含有有机溶剂的溶液洗涤点样膜，以洗去中药注射剂斑点的本色；３）随后将点样膜进行考马斯亮蓝染色。如果中药注射剂所含的蛋白质不低于１２μｇ／ｍｌ，就会在膜上显示稳定可辨的蓝色。本发明专利技术的检测灵敏度高于磺基水杨酸沉淀法，同时较强的抗干扰能力，适用于所有中药注射剂微量蛋白质的检测。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及中药注射剂杂质检测领域，用于中药注射剂蛋白质类杂质，以控制中 药注射剂的质量。
技术介绍
中药注射剂最早产生在1946年，由钱信忠等学者开创。在中国医药界，中药注射 剂已经广泛应用于临床。2005年版《中华人民共和国药典》(简称《中国药典》)一部就收 录有灯盏细辛、清开灵、止喘灵及双黄连等单方和复方注射剂。中药注射剂在推进中药剂型 发展，拓展中药的应用范围，服务广大人民健康等方面的确功不可没。安全、有效、质量可控 依然是中药注射剂的基本质量要求。从技术上来讲，业界大体上已经解决了中药注射剂的 有效性问题，对于安全性依然是业界难题。然而，随着中药注射剂的广泛应用于临床，其不良反应日益暴露，特别是致死性不 良反应也屡有报道。根据目前公开的不良反应资料，中药注射剂的不良反应可以累及各个 系统和脏器，甚至导致死亡。很多中药注射剂的不良反应与原有的药理作用无关，根据多方 面分析，这些不良反应主要属于过敏反应，即病理性免疫反应，包括I、II、III和IV型病理 性免疫反应。因此减少中药注射剂中的过敏性物质是提高中药注射剂安全性的关键策略之O中药注射剂大多为植物提取物。作为生物提取物，在原料提取过程中会带来多种 植物大分子杂质，如蛋白质、核酸等。尽管植物中的蛋白质含量较低，通过有机溶剂提取的 量较少，但微量的蛋白仍足以导致诱发过敏反应。与人相比，植物蛋白与人的同源性差异 大，因此常具有很强的抗原性。现行药典(2010年版)控制中药注射剂蛋白含量的方法沿 用了以前的磺基水杨酸比浊法，控制的蛋白质限量约为37 110μ g/ml左右，低于此限量 的蛋白药典方法很难检出。因此，蛋白含量低于37 μ g/ml的中药注射剂将被视为“合格”。 而且中药注射剂中的酸性成分会干扰磺基水杨酸法检测蛋白的结果，这导致磺基水杨酸法 应用范围受限。而其他未被药典采用的蛋白质检测方法如，凯氏(Kjeldahl)定氮法、双缩 脲法、Folin-酚试剂法、直接考马斯亮兰法(Bradford法)、紫外吸收法以及BCA法等，却因 为中药注射剂其他成分或本身颜色带来严重干扰，要么特异性较差，要么灵敏度较差，不适 合用于中药注射剂的蛋白质限量检测。为了提高安全性，有必要进一步控制中药注射剂中 的蛋白含量，因此建立特异性高并且灵敏的中药注射剂蛋白质检测方法很有必要。由于中药注射剂都有较深的颜色，成分多样，而且蛋白质是一类物质，因此很难用 目前单一方法同时提高检测的灵敏性和特异性。因此本专利技术是针对中药注射剂的特点而建 立的，对蛋白质检测具有灵敏度高、抗干扰能力强的特点。
技术实现思路
本专利技术利用某些膜能将蛋白质特异性高强度吸附的特点以及考马斯亮蓝对蛋白 质特异性显色的特点建立本方法，以提高中药注射剂微量蛋白检测的灵敏性和特异性。本方法包括以下三个步骤1、先将中药注射剂样品点到蛋白特异性吸附膜上；2、用含有有机溶剂的溶液洗涤点样膜，以洗去中药注射剂斑点的本色；3、将点样膜进行考马斯亮蓝显色。在以上步骤1中，吸附蛋白质的膜包括但不限于硝酸纤维素膜、尼龙膜、PVDF膜 (Polyvinylidene fluoride,聚偏二氟乙烯膜)。 在以上步骤2中，采用的有机溶液浓度为0-100 %，有机溶剂包括但不限于甲醇、乙醇、乙腈、丙酮、氯仿。采用有机溶液洗涤的量和洗涤的次数不限，以去除中药注射剂本色 为度。如果中药注射剂点样后几乎无色，本步骤可以跳过直接进入步骤3。步骤3进行考马斯亮蓝显色时，考马斯亮蓝的浓度不限。可以直接染色；也可以染 色后进行脱色处理，以降低膜的背景。含有一定蛋白质浓度的中药注射剂会显示出稳定的' τπ. ο本方法实施的效果是，检测的灵敏性和特异性高，抗干扰能力强。 附图说明图1为建立PVDF膜吸附染色检测蛋白方法，确定本专利技术检测限的染色结果图a 为点样后风干拍片的结果，b为甲醇洗涤后风干拍片的结果，c为染考马斯亮蓝并脱色后风 干拍片的结果，a、b、c中的A组样品来自标准BSA溶液，用PBS溶液配制，B组为用丹参注 射液配制的BSA样品，从左至右浓度依次均为9mg/ml、3mg/ml、lmg/ml、0. 33mg/ml、0. lmg/ ml>37 μ g/ml>12 μ g/ml、4y g/ml、l. 3 μ g/ml>0 μ g/ml,点样量为 1 μ 1。图2为本专利技术的回收实验染色结果图a为点样后拍片结果；b为甲醇洗涤后拍片 结果；c为染色脱色后的结果，A组样品来自标准蛋白溶液(用PBS配制)，C组样品为用 双黄连注射液液溶解、稀释的蛋白BSA溶液。两组从左至右蛋白浓度均为9mg/ml、3mg/ml、 lmg/ml、0. 33mg/ml、0. lmg/ml、37μ g/ml、12 μ g/ml、4μ g/ml、1. 3 μ g/ml、0μ g/ml，点样量 1μ 1 ；图3为本专利技术与磺基水杨酸比浊法结果比较染色图Β组为标准蛋白样品对照， H组为磺基水杨酸法沉淀后的蛋白样品，两组从左至右起始蛋白浓度均为9mg/ml、3mg/ml、 lmg/ml、0. 33mg/ml、0. lmg/ml>37 μ g/ml、12 μ g/ml>4 μ g/ml、l. 3 μ g/ml>0 μ g/ml。点样量 1μ 1 ；图4为本专利技术的抗干扰实验染色图a为点样后的拍片结果；b为甲醇洗涤后的拍 片结果；图c为染色脱色后的结果，A5样品为标准BSA溶液，浓度为37yg/ml，点0-3为鞣质 样品浓度依次为 109. 2mg/ml、36. 4mg/ml、12. lmg/ml、4mg/ml，点 4 为 Omg/ml，点样量 1 μ 1 ；图5为本专利技术染色10天后的稳定性考察图a为8号膜染色原图结果，b为8号膜 室温下放置10天后的染色变化的结果；图6为本专利技术染色30天及60天后的稳定性考察图a为10号膜原染色结果；b为 10号膜染色室温下放置30天后的结果，c为10号膜染色室温下放置60天后的结果；图7为模拟中药注射剂生产过程，验证其蛋白质残存的检测结果点1-7分别为蛋 白质80%乙醇上清液浓缩1、3、9、27、81、243、729倍，点B5处BSA浓度为37 μ g/ml，点样量 1μ 1 ；图8为中药注射剂成品微量蛋白质检查结果a为点样后拍片结果，b为甲醇洗涤 后的拍片结果，c为染色脱色后的拍片结果，点1样品为标准BSA样品，浓度为37 μ g/ml， “2”列为丹参注射剂，“3”列为灯盏细心注射剂，“4”列为双黄连注射剂，“5”列为清开灵注 射剂，从上往下“1”排为1倍浓度；“2”排为2倍浓度、“5”排为5倍浓度、“10”排为10倍 浓度，点样量1 μ 1。具体实施例方式实施示例1 建立PVDF膜吸附染色检测蛋白方法，确定本专利技术的检测限取10 支试管管编号 0-9，用 PBS(KC1，0. 2g ;ΚΗ2Ρ04，0· 2g ;NaCl，8. Og ； Na2HPO4 ·12Η20，2· 08g ；加三蒸水到1000ml,pH 7. 2)和BSA(牛血清白蛋白)配制出浓度为 9mg/ml的BSA溶液于0号管中，在1-9号管中各加入200 μ 1 PBS，0号管中取100 μ 1溶液 至1号管中混勻，再从1号管本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测中药注射剂微量蛋白质的方法，其特征在与按以下步骤进行：１）先将中药注射剂样品点到蛋白特异性吸附膜上；２）用含有有机溶剂的溶液洗涤点样膜，以洗去中药注射剂斑点的本色；３）将点样膜进行考马斯亮蓝染色。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：段为钢，李奇峰，卢国勋，
申请(专利权)人：云南中医学院，
类型：发明
国别省市：53[中国|云南]