【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物检测领域，尤其涉及用于检测定量pg13细胞dna片段大小分布的引物对及检测方法。
技术介绍
1、近年来，随着基因修饰技术的迅速发展，基因修饰细胞治疗产品已成为医药领域的研究热点。2021年2月，cde发布《基因修饰细胞治疗产品非临床研究与评价技术指导原则(试行)》，将基因修饰细胞治疗产品定义为“基因修饰细胞治疗产品是指经过基因修饰(如调节、修复、替换、添加或删除等)以改变其生物学特性、拟用于治疗人类疾病的活细胞产品，如基因修饰的免疫细胞(如t细胞、nk细胞、树突状细胞和巨噬细胞等)和基因修饰的干细胞(如造血干细胞、多能诱导干细胞等)等”。
2、逆转录病毒载体可以整合7.5kb左右外源基因整合入靶细胞基因组并稳定持久地表达，在基因治疗与细胞治疗领域具有广泛的应用。在逆转录病毒的生产上，pg13是其常见的稳定包装细胞系之一。1991年，a.dusty miller等基于小鼠成纤维细胞nih 3t3构建了表达莫罗尼鼠白血病病毒(momlv)gag-pol蛋白和长臂猿白血病病毒包膜(galv-env)蛋白的逆转录病毒包装细胞系pg13，该细胞系可以产生高滴度(大于106cfu/ml)、广宿主范围(大鼠、仓鼠、牛、猫、狗、猴和人)的逆转录病毒载体。有研究表明，pg13细胞系生产的逆转录病毒载体对于人外周血淋巴细胞具有较高的亲嗜性，这可能与该逆转录病毒载体的galv-env与人t淋巴细胞中高表达的长臂猿白血病病毒受体(glvr-1)亲和性高有关。由pg13生产得到的逆转录病毒载体可用于制备car-t、tcr-t
3、但在逆转录病毒载体的生产过程中，pg13宿主细胞残留dna增加了中间品、成品的致瘤性、免疫原性等生物安全性风险，dna片段越大，则生物安全性风险越高。有研究表明，一个功能基因的片段长度至少为200bp。因此从产品质量控制的角度，需要pg13宿主细胞残留dna片段的含量和片段分布情况进行监测。国内外监管机构对于疫苗中的残留dna的量和残留片段的大小分布等有强烈的关注。对于不同宿主细胞、给药方式和频率，一般允许的宿主残留dna含量在100pg～10ng/剂之间，最大可承受量为10ng/剂；对于dna大小片段的要求则为小于一个功能基因的长度。fda要求测试成品中的残留dna的数量和片段大小的分布情况，并在关于人类基因治疗新产品生产指导文件中明确指出残留dna的片段要小于200bp。国家药品监督管理局(nmpa)生物制品药学部在《基因治疗产品药学研究与评价技术指导原则(征求意见稿)》中指出，残留dna片段应小于200bp。
4、对于dna片段分布的检测方法主要有毛细管电泳(capillary electrophoresis，ce)法和定量pcr(qpcr)法。ce法是指以弹性石英毛细管为分离通道，以高压直流电场为驱动力，根据供试品中各组分淌度(单位电场强度下的迁移速度)和(或)分配行为的差异而实现分离的一种分析方法，其检测灵敏度根据仪器、试剂的不同约为1～5pg/μl，通常用作定性分析。qpcr法是一种在dna扩增反应中，根据每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数(ct值)和标准曲线浓度，从而定量分析未知样品核酸浓度的技术。相较于ce法，qpcr法灵敏度更高(可达fg级别)，能够定量分析以及对dna进行种属鉴别，已被写入《中国药典》、《美国药典》的外源性dna残留量测定方法相关章节。
5、综上可知，生物制品行业亟需一种灵敏、稳定、高效的方法，用于分析pg13细胞基质生物制品中的宿主细胞残留dna片段，但尚未见相关报道。2021年王俊涛等公开了一种《pg13宿主细胞dna残留检测试剂盒及检测方法》，用于检测由pg13细胞表达或生产的产品中dna残留量。该法使用与人转座子序列(human alu transposon element)发挥相似作用的家鼠短序列b2 sequences作为pg13细胞的宿主dna检测的靶序列，片段长度为150bp-200bp。由此可知，该靶标无法设计大片段检测体系或体现残留dna片段分布情况。
6、为了解决现有技术中缺乏一种灵敏、稳定、高效的方法，用于分析pg13细胞基质生物制品中的宿主细胞残留dna片段的引物对或方法，本专利技术提供了定量检测pg13细胞dna片段大小分布的引物对及其方法。本专利技术旨在提供一种基于实时荧光定量pcr(real-timeqpcr)技术定量检测pg13残留dna片段大小分布的引物对、方法和试剂盒，用于分析生物制品中间品、成品中的pg13残留dna片段大小分布。
7、参考文献：
8、miller a d,garcia j v,suhr n v,et al.construction and properties ofretrovirus packaging cells based on gibbon ape leukemia virus.[j].journal ofvirology,1991,65(5):2220-2224.doi:10.1016/0166-0934(91)90062-5.
9、bunnell b a,muul lm,donahue r e,et al.high-efficiency retroviral-mediated gene transfer into human and nonhuman primate peripheral bloodlymphocytes[j].proceedings of the national academy of sciences,1995,92(17):7739-7743.doi:10.1073/pnas.92.17.7739.
10、lam j s,reeves m e,cowherd r,et al.improved gene transfer into humanlymphocytes using retroviruses with the gibbon ape leukemia virus envelope.[j].human gene therapy,1996,7(12):1415.doi:10.1089/hum.1996.7.12-1415.
11、lamers c h j,willemsen r a,luider b a,et al.protocol for genetransduction and expansion of human t lymphocytes for clinical immunogenetherapy of cancer[j].cancer gene therapy,2002,9(7):613-623.doi:10.1038/sj.cgt.7700477.
12、omori f,juopperi t,chan c k,et al.retroviral-mediated transfer andexpression of the multidrug res本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.用于定量检测PG13细胞DNA片段大小分布的引物对，其特征在于，
2.根据权利要求1所述用于定量检测PG13细胞DNA片段大小分布的引物对，其特征在于，所述引物对选自以下引物对：
3.根据权利要求2所述用于定量检测PG13细胞DNA片段大小分布的引物对，其特征在于，所述引物对选自以下引物对：
4.根据权利要求2或3所述用于定量检测PG13细胞DNA片段大小分布的引物对，其特征在于，
5.用于定量检测PG13细胞残留DNA的检测试剂，其特征在于，
6.根据权利要求5所述的用于定量检测PG13细胞残留DNA的检测试剂，其特征在于，
7.用于定量检测PG13细胞残留DNA的检测试剂盒，其特征在于，
8.一种PG13细胞残留DNA的定量检测方法，其特征在于，
9.权利要求1～4中任意一项所述的引物对或者如权利要求5～6所述的检测试剂或者权利要求7所述的检测试剂盒的用途，用于检测待测对象中是否存在PG13细胞残留DNA及其片段大小分布。
10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于
...【技术特征摘要】
1.用于定量检测pg13细胞dna片段大小分布的引物对，其特征在于，
2.根据权利要求1所述用于定量检测pg13细胞dna片段大小分布的引物对，其特征在于，所述引物对选自以下引物对：
3.根据权利要求2所述用于定量检测pg13细胞dna片段大小分布的引物对，其特征在于，所述引物对选自以下引物对：
4.根据权利要求2或3所述用于定量检测pg13细胞dna片段大小分布的引物对，其特征在于，
5.用于定量检测pg13细胞残留dna的检测试剂，其特征在于，
6.根据权...
【专利技术属性】
技术研发人员：袁小铃，杨志行，李康凯，张琪梦，程丹妮，
申请(专利权)人：湖州申科生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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