检测猪源DNA的引物及检测方法技术

本发明专利技术提供了检测猪基因组DNA的引物对、包含本发明专利技术引物对的检测试剂或试剂盒以及利用所述引物对检测猪基因组DNA的方法，所述引物对特异性结合于SEQ ID NO:1所示序列。利用所述引物对的PCR检测方法操作简便快捷、灵敏度高、能区分牛、CHO、Vero、人、NS0、MDCK、E.coli、毕赤酵母和Sf9等干扰性DNA。毕赤酵母和Sf9等干扰性DNA。

【技术实现步骤摘要】
检测猪源DNA的引物及检测方法


[0001]本专利技术涉及生物检测领域。具体地说，本专利技术涉及检测生物材料中猪源DNA残留的引物及检测方法。

技术介绍

[0002]生物源细胞外基质(ECM)广泛应用于再生医学与组织工程医疗领域，天然来源的细胞外基质具有自然形态的三维构造，富含胶原蛋白和生长因子，提供诱导细胞黏附，增殖和扩散的微环境，促进组织恢复正常结构和功能。生物源细胞外基质主要来源于人或哺乳动物的组织器官，如真皮，膀胱，小肠和心包膜等，由于猪的组织器官来源广泛且生物相容性高，是主要的脱细胞基质的原材料。猪源脱细胞基质组成的生物材料在临床用于血管、皮肤、肠道、心脏等组织器官的修复和再生，医疗器械产品包括生物疝修补片、口腔修复膜、生物补片、创面敷料等。
[0003]脱细胞和灭菌处理用于去除动物组织中的细胞成分和有害微生物，这些细胞成分和核酸残留是导致患者在植入时产生免疫原性风险的主要原因，严重的会导致炎症反应，剧烈疼痛和非感染性水肿等负面作用。因此对脱细胞效果的评估是进行生物材料质量安全控制的重要措施之一，目前主要通过定量检测脱细胞基质生物材料中残留的细胞成分，如双链DNA等来评估脱细胞结果。国内动物源性医疗器械行业标准YY/T 0771等和《动物源性医疗器械产品注册技术审查指导原则》对使用动物组织或其衍生物制造的医疗器械均提出了风险管理要求。
[0004]基于核酸的分子生物学技术如荧光定量PCR可以利用特异性荧光标记的Taqman探针对样本中残留DNA进行定量检测分析，带有荧光基团的探针在热循环过程中不断激发荧光信号，通过监测积累的荧光信号的变化反映PCR过程中产物的增加，从而实现对目标DNA的定量分析。实时荧光定量PCR检测技术具有特异性好、准确性高和速度快等优势。
[0005]目前，对于猪源成分检测主要集中在肉类食品、明胶等食品领域，应用于动物源性生物材料的医疗器械中残留DNA检测较少；此外，猪源qPCR的靶标设计通常使用单拷贝基因或线粒体基因，这些基因的拷贝数低或在细胞中不恒定，可能会导致定量偏差或者出现假阴性情况，不适用于生物材料痕量残留DNA的定量检测。高度重复序列在猪等哺乳动物中的重复次数可到达十万次以上，且在各染色体中分别均匀稳定。因此，基于高度重复序列靶标的荧光定量PCR方法可以大大提高检测的灵敏度、特异性和准确性。可以用于建立一套生物材料中痕量残留猪源DNA定量qPCR检测方法，有效减少和避免应用于临床或医美医疗器械的安全隐患。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是提供一种高灵敏度，高特异性地检测生物材料中猪源DNA残留的引物对，以及包含所述引物对的检测试剂或PCR试剂盒。
[0007]本专利技术的另一目的是提供利用本专利技术提供的引物对或检测试剂检测生物材料中
猪源DNA残留的方法或PCR方法。
[0008]在第一方面，本专利技术提供一种检测猪基因组DNA的引物对，所述引物对包括正向引物和反向引物，其中所述正向引物结合于猪基因组DNA上SEQ ID NO:1所示序列的第2
‑
30位，优选第5
‑
24位；其中的反向引物结合于猪基因组DNA上SEQ ID NO:1所示序列的第120
‑
150位，优选第127
‑
143位；并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为139
‑
149bp。
[0009]在优选的实施方式中，所述正向引物和反向引物的长度为16～22bp；优选20bp。
[0010]在优选的实施方式中，所述正向引物和反向引物的Tm温度为58～60℃，并且正向引物的Tm与反向引物的Tm的差值的绝对值≤2℃。
[0011]在具体的实施方式中，所述引物对中，所述正向引物如SEQ ID NO:2所示，所述反向引物如SEQ ID NO:3所示。
[0012]在第二方面，本专利技术提供一种检测试剂，所述检测试剂包含第一方面所述的引物对。
[0013]在优选的实施方式中，所述检测试剂还包含探针。
[0014]在优选的实施方式中，所述探针如SEQ ID NO:4所示。
[0015]在第三方面，本专利技术提供一种检测试剂盒，所述检测试剂盒包含第一方面所述的引物对或第二方面所述的检测试剂，还任选包含利用所述引物对或检测试剂检测猪源DNA的使用说明书。
[0016]在具体的实施方式中，所述检测试剂还包含探针。
[0017]在优选的实施方式中，所述探针如SEQ ID NO:4所示。
[0018]在具体的实施方式中，所述引物对中正向引物如SEQ ID NO:2所示，所述反向引物如SEQ ID NO:3所示，所述探针如SEQ ID NO:4所示。
[0019]在优选的实施方式中，所述检测试剂的检测灵敏度为10fg/反应。
[0020]在第四方面，本专利技术提供一种检测猪基因组DNA的方法，所述方法包括：利用第一方面所述的引物对或第二方面所述的检测试剂或第三方面所述的检测试剂盒，对待测样品进行PCR，并检测PCR扩增产物。
[0021]在第五方面，本专利技术提供一种PCR试剂盒，所述试剂盒中包括容器以及位于所述容器中的第一方面所述的引物对。
[0022]在优选的实施方式中，所述正向引物和反向引物的长度为16～22bp；优选20bp。
[0023]在优选的实施方式中，所述正向引物和反向引物的Tm温度为58～60℃，并且正向引物的Tm与反向引物的Tm的差值的绝对值≤2℃。
[0024]在优选的实施方式中，所述试剂盒中还装有探针。
[0025]在优选的实施方式中，所述探针如SEQ ID NO:4所示。
[0026]在优选的实施方式中，所述检测试剂的检测灵敏度为10fg/反应。
[0027]在优选的实施方式中，所述试剂盒中还装有标准品对照。
[0028]在第六方面，本专利技术提供一种PCR方法，包括步骤：
[0029]在一PCR检测体系中，利用第一方面所述的引物对扩增目标产物。
[0030]在优选的实施方式中，所述正向引物和反向引物的长度为16～22bp；优选20bp。
[0031]在优选的实施方式中，所述正向引物和反向引物的Tm温度为58～60℃，并且正向引物的Tm与反向引物的Tm的差值的绝对值≤2℃。
[0032]在优选的实施方式中，所述试剂盒中还装有探针。
[0033]在优选的实施方式中，所述探针如SEQ ID NO:4所示。
[0034]在第七方面，本专利技术提供第一方面所述的引物对或第二方面所述的检测试剂或第三方面所述的检测试剂盒的用途，用于检测待测对象中是否存在猪基因组DNA。
[0035]在优选的实施方式中，所述待测对象是猪源脱细胞基质；优选来源于猪的真皮、膀胱、小肠和心包膜的脱细胞基质，包括但不限于生物疝修补片、口腔修复膜、生物补片、创面敷料、胶原蛋白、心包生物瓣膜、眼科植入角膜、人工皮肤、医用缝合材料等。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测猪基因组DNA的引物对，所述引物对包括正向引物和反向引物，其中所述正向引物结合于猪基因组DNA上SEQ ID NO:1所示序列的第2
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30位，优选第5
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24位；其中的反向引物结合于猪基因组DNA上SEQ ID NO:1所示序列的第120
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150位，优选第127
‑
143位；并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为139
‑
149bp。2.如权利要求1所述的引物对，其特征在于，所述引物对中，所述正向引物如SEQ ID NO:2所示，所述反向引物如SEQ ID NO:3所示。3.一种检测试剂，所述检测试剂包含权利要求1或2所述的引物对。4.一种检测试剂盒，所述检测试剂盒包含权利要求1或2所述的引物对或权利要求3所述的检测试剂，还任选包含利用所述引物对或检测试剂检测猪源DNA的使用说明书...

【专利技术属性】
技术研发人员：魏利娜，吴婉欣，陈亮，宗伟英，李康凯，吴晓双，邵安良，段晓杰，范行良，陈丽媛，张潇，徐丽明，李静莉，
申请(专利权)人：湖州申科生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：