用于检测Sf9细胞DNA片段大小分布的引物对及检测方法技术

本发明专利技术涉及生物检测领域，尤其涉及用于检测Sf9细胞DNA片段大小分布的引物对及检测方法。所述引物对至少包含4组引物对；各引物对中的正向引物和反向引物分别特异性结合于Sf9细胞基因组DNA上SEQ ID NO:1所示区段；各组引物对扩增获得的扩增产物的长度分别为100bp以下、100

【技术实现步骤摘要】
用于检测Sf9细胞DNA片段大小分布的引物对及检测方法


[0001]本专利技术涉及生物检测领域，尤其涉及用于检测Sf9细胞DNA片段大小分布的引物对及检测方法。

技术介绍

[0002]在基因治疗领域，人胚胎肾细胞(HEK293)和杆状病毒表达载体(Baculovirus expression vectors，BEVs)/草地贪夜蛾卵巢细胞(Spodoptera frugiperda cell，Sf9)表达系统(BEV
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Sf9)是用于生产基因治疗生物制品最主要的两个表达系统。尽管使用HEK293是该行业金标准，但由于哺乳动物需贴壁生长导致放大生产困难。
[0003]昆虫细胞是新兴的生物制品生产基质，其中BEV
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Sf9是最常用的昆虫细胞表达系统，该系统是以杆状病毒作为外源基因载体，以昆虫细胞作为宿主进行基因组自我扩增与目的蛋白表达。相较于HEK293，Sf9昆虫细胞可以在大规模反应器中高密度悬浮培养，而杆状病毒对于哺乳动物和植物是非致病性的，所以BEV
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Sf9表达系统具有易于规模化生产、培养成本低、残留DNA对脊椎动物的生物安全性高等优势，已陆续被研究用于生产重组蛋白、rAAV载体、亚单位疫苗、重组病毒样颗粒(VLP)等。
[0004]1983年，Smith等首次使用BEV
‑
Sf9表达系统获得重组蛋白，该方法被证明是一种经济可行的重组蛋白生产平台。
[0005]2002年，Urabe等通过携带AAV包装基因的重组杆状病毒感染Sf9细胞来生产rAAV，产量远高于HEK293表达系统，可达10
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VG(vector genomes)/L，满足临床rAAV载体用量，为rAAV载体的生产提供了一种简单快捷、经济高效的方法。
[0006]2013年，由Protein Sciences Corporation研制的全球第一支针对流感病毒的三价重组亚单位疫苗(Recombination HA vaccine，rHA vaccine)由美国食品药品监督管理局批准上市，用以预防流感病毒的大面积爆发，该疫苗即以BEV
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Sf9作为表达系统。
[0007]2016年，FDA又通过了覆盖率更高的四价流感疫苗。
[0008]而在新型冠状病毒大流行的背景下，截至2021年7月全球共有32个蛋白亚单元疫苗正在开展临床试验研究，截至2022年7月25日查找到10个新冠重组疫苗(Sf9细胞)提交了临床试验登记。由此可见，Sf9昆虫细胞在生物制品的生产中具有重要地位。
[0009]优质的生物制品能够帮助人类预防、治疗疾病，但是生产过程中引入的宿主细胞残留DNA(Host cell DNA，HCD)会给使用者带来致瘤性、感染性和免疫原性风险。国内外监管机构对于疫苗中宿主细胞DNA的残留量和残留DNA片段的大小分布等有强烈的关注。
[0010]目前可见报道中对生物制品残留DNA片段的分析方法主要有毛细管电泳和定量PCR法(qPCR)。毛细管电泳(capillary electrophoresis，CE)是粒子在高压电场驱动下，在毛细管中按其滴度或分配系数，进行高效、快速分离的一种电泳技术，分为芯片式毛细管电泳(Chip CE)和毛细管阵列电泳(CAE)，可用于对核酸浓度和纯度的测定，检测灵敏度约为1～5pg/μL。定量PCR法(qPCR)是一种在DNA扩增反应中，根据每个反应管内的荧光信号到达
设定的域值时所经历的循环数(Ct值)和标准曲线浓度，从而定量分析未知样品核酸浓度的技术。相较于毛细管电泳法，qPCR法的检测限可达fg级别，具有更高的灵敏度，且qPCR法操作简便、样品通量较高，作为国际公认的残留DNA的检测方法，目前分子生物学实验室已普遍具备qPCR的实验条件。尽管市场对Sf9细胞基质生物制品中的宿主细胞残留DNA片段有着迫切的定量分析需求，但到目前为止尚未见相关报道。
[0011]参考文献：[1]USAMI A,ISHIYAMA S,ENOMOTO C,et al.Comparison of recombinant protein expression in a baculovirus system in insect cells(Sf9)and silkworm[J].Journal of Biochemistry,2011,149(2):219
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9.[8]MENG F
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Y,GAO F,JIA S<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于检测Sf9细胞DNA片段大小分布的引物对，其特征在于，至少包含4组引物对；其中：各引物对中的正向引物和反向引物分别特异性结合于Sf9细胞基因组DNA 上SEQ ID NO:1所示区段；各组引物对扩增获得的扩增产物的长度分别为100bp以下、100
‑
199bp、200
‑
499bp以及499bp以上。2.根据权利要求1所述用于检测Sf9细胞DNA片段大小分布的引物对，其特征在于，所述引物对选自以下引物对：第一引物对，其中的正向引物结合于Sf9细胞基因组DNA上SEQ ID NO:1所示序列的第241
‑
280位；所述反向引物结合于Sf9细胞基因组DNA上SEQ ID NO:1所示序列的第308
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347位，并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为77
‑
97bp；第二引物对，其中的正向引物结合于Sf9细胞基因组DNA上SEQ ID NO:1所示序列的第210
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247位；所述反向引物结合于Sf9细胞基因组DNA上SEQ ID NO:1所示序列的第308
‑
347位，并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为108
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128bp；第三引物对，其中的正向引物结合于Sf9细胞基因组DNA上SEQ ID NO:1所示序列的第238
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279位；所述反向引物结合于Sf9细胞基因组DNA上SEQ ID NO:1所示序列的第442
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482位，并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为215
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235bp；第四引物对，其中的正向引物结合于Sf9细胞基因组DNA上SEQ ID NO:1所示序列的第2
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38位；所述反向引物结合于Sf9细胞基因组DNA上SEQ ID NO:1所示序列的第479
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520位，并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为490
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510bp。3.根据权利要求1或2所述用于检测Sf9细胞DNA片段大小分布的引物对，其特征在于，所述引物对选自以下引物对：第一引物对，其中的正向引物结合于Sf9细胞基因组DNA上SEQ ID NO:1所示序列的第251
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270位；所述反向引物结合于Sf9细胞基因组DNA上SEQ ID NO:1所示序列的第318
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337位，并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为87bp；第...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴婉欣，杨志行，袁小铃，詹蓉，
申请(专利权)人：湖州申科生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：