cdh1基因在鉴别花鲈来源中的应用及其RNA探针和应用制造技术

本发明专利技术涉及cdh1基因在鉴别花鲈来源中的应用及其RNA探针和应用，属于生物检测技术领域，本发明专利技术提供花鲈cdh1基因在鉴别花鲈海水来源和淡水来源中的应用；本发明专利技术首先提供一种花鲈cdh1基因RNA探针，利用所述探针进行花鲈鳃组织原位杂交，根据mRNA阳性信号分布特征区分海、淡水花鲈，还可以通过CDH1蛋白免疫组化技术，从蛋白水平上鉴定两类花鲈，最后还可以通过cdh1基因实时荧光定量PCR技术，从定量的角度区分海淡水花鲈，本发明专利技术可以在不损伤可食用肌肉的情况下，有效应用于鉴别市售活体花鲈是否为真正的野生海捕或海水养殖花鲈。否为真正的野生海捕或海水养殖花鲈。否为真正的野生海捕或海水养殖花鲈。

【技术实现步骤摘要】
cdh1基因在鉴别花鲈来源中的应用及其RNA探针和应用


[0001]本专利技术属于生物检测
，特别涉及一种cdh1基因在鉴别花鲈来源中的应用及其RNA探针和应用。

技术介绍

[0002]花鲈（Lateolabrax maculatus），隶属鲈形目（Perciformes）、鮨科（Serranidae）、花鲈属（Lateolabrax），俗称海鲈、七星鲈、寨花等。花鲈可以适应0~45
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的盐度范围，为典型的广盐性物种，因此海水网箱、海水池塘、内陆及河口池塘等均适合花鲈规模化养殖。然而不同盐度环境下花鲈的品质有所差异，研究表明，海水养殖花鲈肌肉中多不饱和脂肪酸如EPA、DHA的含量显著高于淡水养殖花鲈，而决定食物甜味的关键物质甜菜碱，在海水养殖花鲈中的含量为1.81mg/g，比淡水养殖花鲈高出50%左右。在鱼肉加热后的挥发性物质中，己醛、对二甲苯等物质在淡水花鲈中含量更高，这导致淡水花鲈的腥味更浓。因此海水养殖花鲈无论是营养价值、甜味和鲜味都高于淡水养殖花鲈，因而在市场上二者的售价有明显差别，海水花鲈的市场价值更高。一些不法商贩滥竽充数，将淡水养殖的花鲈当做高品质的海水花鲈进行售卖，侵害了消费者的权益。然而仅从外观上难以区分两类花鲈，并且现有的基于肌肉品质指标的鉴定技术存在准确率低、易对鱼肉造成损伤的缺陷，因此急需开发一种精准的、肌肉无损的测定方法。

技术实现思路

[0003]本专利技术要解决的技术问题提供一种cdh1基因在鉴别花鲈来源中的应用及其RNA探针和应用。
[0004]鳃是鱼类渗透压调节的主要器官，鳃上皮作为维持离子平衡的核心渗透调节位点,通过形态重塑响应环境中的盐度变化。鳃重塑涉及上皮细胞的增殖和分化、分布及离子转运特征的改变等一系列分子机制。E
‑
cadherin（CDH1）是一种定位于上皮细胞基底膜外侧的钙黏蛋白，通过调控Ca
2+
依赖性的细胞黏附，参与形成细胞间粘附连接、维持细胞极性和组织完整性，然而，该基因在鱼类鳃上皮中的功能未见有研究报道。
[0005]本专利技术人的前期研究结果表明，在花鲈的盐度驯化过程中，鳃形态重塑的过程伴随着CDH1介导的鳃上皮细胞极性改变，因此本专利技术以cdh1作为鉴定海、淡水花鲈的分子标记物，通过cdh1基因原位杂交技术，根据其mRNA阳性信号分布特征区分海、淡水花鲈，同时可以通过CDH1蛋白免疫组化技术，从蛋白水平上鉴定两类花鲈，进一步可以利用实时荧光定量PCR技术，从cdh1基因表达量的角度区分海、淡水花鲈。结果表明，在mRNA及蛋白水平，cdh1 /CDH1在海水花鲈的鳃组织中仅分布于鳃小片底部及相邻鳃小片之间的鳃丝上皮，而在淡水花鲈鳃组织的鳃小片上皮（顶部、中部、底部）及相邻鳃小片之间的鳃丝上皮均检测到cdh1 /CDH1分布。此外，淡水中cdh1的mRNA表达量显著高于海水。因此利用cdh1作为分子标记物在mRNA和蛋白水平上均可精准区分海水与淡水花鲈，因此可以进一步应用于鉴定市售活体花鲈是否为真正的野生海捕或海水养殖花鲈。
[0006]本专利技术是通过如下技术方案来实现的：本专利技术提供cdh1基因在鉴别花鲈来源中的应用，所述的来源是海水来源和淡水来源。
[0007]本专利技术还提供一种提供花鲈cdh1基因RNA探针，探针序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8。
[0008]进一步，构建所述探针的引物为F: ATGATGGACACCAGGGC，R: CCAGCGGTTGTGTGAGA。
[0009]本专利技术还提供所述花鲈cdh1基因RNA探针在鉴别花鲈海水或淡水来源中的应用，所述应用方法为利用所述花鲈cdh1基因RNA探针进行花鲈鳃组织原位杂交，根据mRNA阳性信号分布特征区分海、淡水花鲈，cdh1在海水花鲈的鳃组织中仅分布于鳃小片底部及相邻鳃小片之间的鳃丝上皮，而在淡水花鲈鳃组织中分布于鳃小片上皮的顶部、中部、底部及相邻鳃小片之间的鳃丝上皮。
[0010]本专利技术还提供利用所述cdh1基因表达CDH1蛋白的分布特征来鉴别花鲈来源的方法，所述来源为海水或淡水，所述方法为利用免疫组化确定CDH1蛋白的分布特征，CDH1蛋白在海水花鲈的鳃组织中仅分布于鳃小片底部及相邻鳃小片之间的鳃丝上皮，而在淡水花鲈鳃组织中分布于鳃小片上皮的顶部、中部、底部及相邻鳃小片之间的鳃丝上皮。
[0011]本专利技术还提供利用实时荧光定量PCR技术检测花鲈鳃cdh1基因相对表达量来区分花鲈来源于海水或淡水的方法，所述方法为以花鲈的18S作为内参基因，通过实时荧光定量PCR技术检测花鲈cdh1基因在海淡水中的相对表达水平，来源于淡水的花鲈cdh1的mRNA表达量显著高于海水花鲈。
[0012]本专利技术与现有技术相比的有益效果：本专利技术首先通过原位杂交技术检测花鲈鳃cdh1基因，根据其mRNA阳性信号分布特征区分海淡水花鲈，还可以通过CDH1蛋白免疫组化技术，从蛋白水平上鉴定两类花鲈，最后还可以通过cdh1基因实时荧光定量PCR技术，从定量的角度区分海淡水花鲈。本专利技术可以在不损伤可食用肌肉的情况下，有效应用于鉴别市售活体花鲈是否为真正的野生海捕或海水养殖花鲈，还可以为探究鳃上皮细胞在适应不同盐度环境中的增殖及分化的分子机制提供理论和技术支持。此外该专利技术也可以应用于其它鱼类的海淡水来源鉴定，具有广阔的应用前景。
附图说明
[0013]图1为花鲈cdh1基因原位杂交结果图，A：淡水花鲈鳃cdh1定位结果；B：海水花鲈鳃cdh1定位结果。
[0014]图2为花鲈CDH1蛋白免疫组化结果图，A：淡水花鲈鳃CDH1蛋白定位结果；B：海水花鲈鳃CDH1蛋白定位结果。
[0015]图3为花鲈cdh1基因在海淡水中qPCR结果图。A:淡水花鲈鳃cdh1基因表达量；B:海水花鲈鳃cdh1基因表达量。
具体实施方式
[0016]为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下将结合实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。但本专利技术的保护范围不受实施例任何形式上的限制，除非另有特
别说明，本专利技术中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买获得。
[0017]自山东省东营市利津县双瀛水产苗种有限责任公司购得海淡水养殖的花鲈各3尾，平均体重834
±
10.08g。用MS
‑
222（200mg/l）麻醉处理后，收集鳃组织样品，一部分放入1.5ml的无酶EP管并放入液氮中速冻并转移至
‑
80℃超低温冰箱保存，用于RNA的提取；另一部分鳃组织放入4%PFA（多聚甲醛，DEPC水配置）中固定24h后换成70%酒精（DEPC水配置），于
‑
20 ℃保存，用于石蜡切片的制备。
[0018]所有实验设计和实验对象处理均遵循中国海洋大学研究与伦理委员会的指导和批准（20141201）。
[0019]实施例1通过原位杂交技术定位鳃cdh1基因1、花鲈鳃组织总RNA提取：（1）组织裂解本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.cdh1基因在鉴别花鲈来源中的应用，其特征在于，利用所述花鲈cdh1基因鉴别花鲈是海水来源或淡水来源。2.一种花鲈cdh1基因的RNA探针，其特征在于，探针序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8，所述探针构建来源于权利要求1所述的花鲈cdh1基因。3. 构建权利要求2所述探针的引物，其特征在于，所述引物为F: ATGATGGACACCAGGGC ，R: CCAGCGGTTGTGTGAGA。4.一种鉴别花鲈来源的方法，其特征在于，利用权利要求2所述花鲈cdh1基因的RNA探针进行花鲈鳃组织原位杂交，根据mRNA阳性信号分布特征鉴别海水花鲈或淡水花鲈，cdh1基因在海水花鲈的鳃组织中仅分布于鳃小片底部及相邻鳃小片之间的鳃丝上皮，而在淡水花鲈鳃组织中分布于鳃小片上皮...

【专利技术属性】
技术研发人员：李昀，陈通，温海深，李金库，齐鑫，
申请(专利权)人：中国海洋大学，
类型：发明
国别省市：