一种检测蜜蜂梅氏热厉螨的引物探针组合物及其检测方法技术

本发明专利技术公开了一种检测蜜蜂梅氏热厉螨的引物探针组合物及其检测方法。具体地公开了用于检测蜜蜂梅氏热厉螨的引物对，所述引物对为特异性扩增COX1基因或含有所述COX1基因片段的一对引物，所述COX1基因的核苷酸序列为SEQ ID No.1。本发明专利技术利用从国内流行蜂群分离的多株梅氏热厉螨进行DNA扩增和序列分析比对，筛选核酸保守序列作为靶目标，开发了用于检测蜜蜂梅氏热厉螨的引物探针组合物及实时荧光PCR检测方法。本发明专利技术的引物探针组合物及其检测方法灵敏度高，最低检测限为2.0拷贝/μL，并且特异性好，与其他蜂螨均无交叉反应，可用于蜜蜂梅氏热厉螨的检测及其与其他蜂螨的鉴别，以及进出口蜜蜂及蜂产品的检疫。进出口蜜蜂及蜂产品的检疫。

【技术实现步骤摘要】
一种检测蜜蜂梅氏热厉螨的引物探针组合物及其检测方法


[0001]本专利技术涉及动物卫生
，具体涉及一种检测蜜蜂梅氏热厉螨的引物探针组合物及其检测方法。

技术介绍

[0002]梅氏热厉螨(Tropilaelaps mercedesae)是小蜂螨的一个种，属于节肢动物门，蛛形纲，蜱螨亚纲，寄螨总目，中气门目，皮刺螨总科，和柯氏热厉螨(Tropilaelaps koenigerum)、亮热厉螨(Tropilaelaps clareae)、泰氏热厉螨(Tropilaelaps thaii)同属于热厉螨属(Tropilaelaps spp.)，统称小蜂螨。梅氏热厉螨是西方蜜蜂的主要寄生螨，在其原分布区的西方蜜蜂中均能发现，寄生水平能达90％，分布范围比亮热厉螨广，危害性更大，已经发展成西方蜜蜂的一种长期的危害性寄生虫。
[0003]梅氏热厉螨以吸食蜜蜂封盖子的血淋巴为生，常导致大量封盖幼虫和蛹变形或死亡，勉强出房的工蜂也出现体型畸形及机体和生理上的缺陷，致使蜂群的生产力严重下降，直接影响蜂群的发生发展，如果对发病群不加控制，蜂群很快就会死亡。目前小蜂螨的危害性已引起各国养蜂业、研究人员、蜂农的广泛关注。目前对于梅氏热厉螨的检测主要采用形态学方法，结合临床症状，通过开盖检查和箱底检查。由于到目前为止欧洲地区还没有梅氏热厉螨危害的报道，小蜂螨仅对亚洲地区的蜜蜂群产生危害，因此早期没有引起西方国家的重视，国内外对该类螨研究较少，目前还没有对于蜂螨的各个级型(卵、幼虫、若虫和成虫)的形态描述和生活史的详细报道，缺乏该螨典型的形态学鉴别特征，而且蜂群中有100多种与蜜蜂有关的螨，他们形态相似，所以仅靠形态学检查无法准确鉴定，而且实际检测效果也要依靠检测人员的业务水平与经验，容易造成漏检和错检。目前，未见有梅氏热厉螨的实时荧光PCR检测方法的报道。
[0004]鉴于此，研究和开发检测蜜蜂梅氏热厉螨的引物探针组合物及其检测方法，用于蜜蜂梅氏热厉螨的检测及其与其他蜂螨的鉴别，以及进出口蜜蜂及蜂产品的检疫，对于保障我国养蜂业的发展、生物安全和维护自然生态平衡具有重要意义。

技术实现思路

[0005]本专利技术所要解决的技术问题是如何简单、快速、灵敏和/或特异地检测蜜蜂梅氏热厉螨(Tropilaelaps mercedesae)。所要解决的技术问题不限于所描述的技术主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。
[0006]为解决上述技术问题，本专利技术首先提供了用于检测蜜蜂梅氏热厉螨的引物对，所述引物对可为特异性扩增蜜蜂梅氏热厉螨线粒体细胞色素C氧化酶亚基I(cytochrome c oxidase subunit I,COX1)基因或含有所述COX1基因片段的一对引物，所述COX1基因的核苷酸序列可为SEQ ID No.1。
[0007]进一步地，所述引物对由引物TME
‑
F和引物TME
‑
R组成，所述引物TME
‑
F可为SEQ ID No.2所示的单链DNA分子；所述引物TME
‑
R可为SEQ ID No.3所示的单链DNA分子。
[0008]所述引物TME
‑
F为正向引物，所述引物TME
‑
R为反向引物。
[0009]所述正向引物TME
‑
F和反向引物TME
‑
R为特异性扩增蜜蜂梅氏热厉螨(Tropilaelaps mercedesae)的COX1基因的引物对，即用于检测蜜蜂梅氏热厉螨的特异引物对。
[0010]本专利技术还提供了用于检测蜜蜂梅氏热厉螨的组合物(引物探针组合物)，所述组合物可由所述引物对和蜜蜂梅氏热厉螨特异性探针组成，所述蜜蜂梅氏热厉螨特异性探针可为与所述COX1基因特异结合的单链DNA分子。
[0011]所述探针可为TaqMan探针，名称为TME
‑
P。
[0012]上述组合物中，所述探针TME
‑
P的核苷酸序列可为SEQ ID No.4。
[0013]上述组合物中，所述探针TME
‑
P的5
’
端标可记荧光基团，3
’
端可标记淬灭基团。
[0014]所述荧光基团选自FAM、6
‑
FAM、VIC、HEX、TRT、CY3、CY5、ROX、JOE、FITC、TET、NED、TAMRA、LC RED640、LC RED705、Quasar705或Texas Red中的至少一种。
[0015]所述淬灭基团选自TAMRA、BHQ1、BHQ2、BHQ3、MGB、Dabcy1中的至少一种。
[0016]上述组合物中，所述探针的5
’
端可标记ROX，3
’
端可标记BHQ
‑
2(BHQ2)。
[0017]本专利技术还提供了用于检测蜜蜂梅氏热厉螨的试剂或试剂盒，所述试剂或试剂盒包含所述引物对或本文中任一所述的组合物。
[0018]进一步地，所述试剂盒还包括PCR扩增所需要的Taq DNA聚合酶、dNTP、PCR缓冲液、Mg
2+
中的一种或多种。
[0019]所述试剂盒的各种试剂组分可以存在于分开的容器中，或者可以全部或部分预组合成试剂混合物。
[0020]进一步地，所述试剂盒还可包括记载有本文中所述检测蜜蜂梅氏热厉螨的方法的可读性载体。所述可读性载体可为关于实践本专利技术方法的试剂盒说明书(例如印刷形式的说明书)或在其上已记录了信息的计算机可读的介质(例如软盘、CD等)。
[0021]本专利技术还提供了所述引物对，和/或，本文中任一所述组合物的下述任一种应用：
[0022]A1)在检测蜜蜂梅氏热厉螨或制备用于检测蜜蜂梅氏热厉螨的产品中的应用；
[0023]A2)在检测COX1基因或制备用于检测COX1基因的产品中的应用；
[0024]A3)在鉴定或辅助鉴定蜜蜂梅氏热厉螨中的应用；
[0025]A4)在制备用于鉴定或辅助鉴定蜜蜂梅氏热厉螨的产品中的应用；
[0026]A5)在鉴别区分蜜蜂梅氏热厉螨和其他蜂螨或制备用于鉴别区分蜜蜂梅氏热厉螨和其他蜂螨的产品中的应用；
[0027]A6)在蜜蜂梅氏热厉螨防控中的应用。
[0028]本文所述产品可为试剂、试剂盒、芯片或试纸。
[0029]本专利技术还提供了非疾病诊断目的的检测蜜蜂梅氏热厉螨的方法，所述方法可包括使用所述引物对或本文中任一所述组合物对待测样品进行PCR扩增反应，根据PCR扩增产物确定待测样品是否含有蜜蜂梅氏热厉螨或待测样品是否为蜜蜂梅氏热厉螨。
[0030]进一步地，上述方法中，所述PCR扩增反应可为实时荧光定量PCR反应。
[0031]进一步地，上述方法中，所述实时荧光定量PCR反应体系包括：PCR buffer、MgCl2、dNTPs、引物TME
‑...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于检测蜜蜂梅氏热厉螨的引物对，其特征在于，所述引物对为特异性扩增COX1基因或含有所述COX1基因片段的一对引物，所述COX1基因的核苷酸序列为SEQ ID No.1。2.根据权利要求1所述的引物对，其特征在于，所述引物对由引物TME
‑
F和引物TME
‑
R组成，所述引物TME
‑
F为SEQ ID No.2所示的单链DNA分子；所述引物TME
‑
R为SEQ ID No.3所示的单链DNA分子。3.用于检测蜜蜂梅氏热厉螨的组合物，其特征在于，所述组合物由权利要求1或2所述的引物对和蜜蜂梅氏热厉螨特异性探针组成，所述蜜蜂梅氏热厉螨特异性探针为与所述COX1基因特异结合的单链DNA分子。4.根据权利要求3所述的组合物，其特征在于，所述探针的核苷酸序列为SEQ ID No.4。5.根据权利要求3或4所述的组合物，其特征在于，所述探针的5
’
端标记荧光基团，3
’
端标记淬灭基团。6.根据权利要求5所述的组合物，其特征在于，所述探针的5
’
端标记ROX，3
’
端标记BHQ
‑
2。7.用于检测蜜蜂梅氏热厉螨的试剂或试剂盒，其特征在于，所述试剂或试剂盒包含权利要求1或2所述的引物对或权利要求3
‑
6中任一所述的组合物。8.权利要求1或2所述的引物对，和/或，权利要求3
‑
6中任一所述组合物的下述任一种应用：A1)在检测蜜蜂梅氏热厉螨或制备用于检测蜜蜂梅氏热厉螨的产品中的应用；A2)在检测COX1基因或制备用于检测COX1基因的产品中的应用；A3)在鉴定或辅助鉴定蜜蜂梅氏热厉螨中的应用；A4)在制备用于鉴定或辅助鉴定蜜蜂梅氏热厉螨...

【专利技术属性】
技术研发人员：张体银，黄嫦娇，肖颖，孙洁，郑腾，王武军，
申请(专利权)人：福州海关技术中心，
类型：发明
国别省市：