rcAAV5检测用探针和引物组合及其用途制造技术

本发明专利技术提供了检测rcAAV5的引物和探针组合以及其用途。通过本发明专利技术的引物和探针组合进行检测时，可以快速、灵敏、准确且低成本地检测rAAV5中rcAAV5的污染率。rAAV5中rcAAV5的污染率。

【技术实现步骤摘要】
rcAAV5检测用探针和引物组合及其用途


[0001]本申请涉及病毒检测领域，更具体涉及重组腺相关病毒中复制型重组腺相关病毒的检测。

技术介绍

[0002]腺相关病毒(adeno
‑
associated virus,AAV)属细小病毒科无包膜的线状DNA病毒，只有在辅助病毒(通常是腺病毒)存在下才能实现病毒复制。AAV能感染多种类型的人体细胞因此又被分为多种血清型。典型的AAV2基因组约4800bp，由两个反向末端重复序列(inverted terminal repeat或ITR，145bp)和两个开放阅读框(ORF)rep和cap基因组成。ITR对于病毒的复制和包装起决定性作用，是合成互补DNA链所必需的。cap基因编码病毒衣壳蛋白，rep基因参与病毒的复制和整合。据报道，灵长类动物体内有13种不同血清型的AAV(即AAV1
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AAV13)，其中AAV2、AAV3、AAV9源自人类本身，AAV2是最早被克隆的病毒，也是迄今研究最为彻底、应用最为广泛的病毒。相对于AAV2，AAV5在进化上与其距离甚远，且两者间的同源序列较少，研究也较少，但AAV5的应用范围很广，能感染眼睛、中枢神经系统、胰脏、肺等人体重要的器官组织。
[0003]重组腺相关病毒(Recombination adeno
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associated virus,rAAV)是在非致病的野生型AAV基础上改造而成的基因载体，rAAV包装的基因组删除了全部AAV蛋白编码序列，并且添加治疗性基因表达盒，唯一的病毒来源序列是ITR，它们是在载体生产过程中指导基因组复制和包装所必需的。由于rAAV病毒载体具有种类多样、免疫原性极低、安全性高、宿主细胞范围广(对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力)、扩散能力强、体内表达基因时间长等优势，所以又被视为最有前途的基因研究和基因治疗载体之一。
[0004]然而，在生产rAAV载体过程中，转染用的质粒或宿主细胞DNA与rAAV之间会由于物理接近而产生大量的rAAV载体基因组、rep和cap基因以及ITR序列发生非同源重组，从而形成具有复制能力的AAV(Replication competent AAV,rcAAV)。
[0005]虽然rcAAV颗粒与任何已知的人类疾病无关，但作为污染物rcAAV颗粒可能会影响rAAV基因表达，并且在许多AAV基因转移研究中是一个不受控制的变量。近期的动物实验表明，cap基因在体内的表达会引发严重的免疫反应，而包装有其他DNA杂质的rcAAV则具有致瘤性或引入抗生素抗性的潜在风险。采用传统工艺生产的rAAV中，rcAAV污染率可高达10％，即使采用优化工艺，rcAAV污染率也可达到0.4％
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1％，因此，rAAV中rcAAV污染率的测定非常必要。
[0006]由于rAAV制品中rcAAV的危害不小，但污染量相对较低，因此必须设计出高灵敏度的方法才能对其进行检测和定量分析。现有的检测方法有两种：一种是利用细胞培养法结合qPCR的方法，另一种是qPCR快检法。前一种方法目前最常用，但也存在不可避免的弊端：首先，它的敏感性依赖于rcAAV对靶细胞的感染效率，相较于AAV2型来说许多其他AAV血清型(1、3、5、6、7)在培养过程中不能有效地感染靶细胞(例如HECK293/293T细胞)，导致检测灵敏度降低，检测值会低于实际值；其次，该方法耗时较长，投入成本较高。qPCR快检法(直
接检测法)恰恰可以弥补细胞培养法的不足，它可以在短时间内实现对rcAAV的检出，但因检测片段太短不能保证检物具备rcAAV复制所需的完整序列，故导致检出的rcAAV不一定具有复制能力，检测值一般会高于实际值。
[0007]然而本领域仍然需要能够快速、灵敏且准确地检测rAAV5中rcAAV5污染率的低成本方法。

技术实现思路

[0008]本专利技术是基于下列发现而完成的：专利技术人首次发现，针对5型rcAAV(rcAAV5)的靶标基因ITR
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Rep(ITR即反向末端重复序列)设计的引物和探针序列，比检测单基因的准确性更高，并且可以用于细胞培养法也可以用于快检法，并且尤其可用于qPCR快检法，实现了两种检测方法互相验证的目的。例如，在对rAAV5制品中的rcAAV5进行检测时，可先用qPCR快检的方法对rcAAV5进行检测，若满足质控标准可不再进行细胞培养法检测，若超出质控标准，需进一步利用细胞培养法对rcAAV5进行检测。另外，在检测样品时，优选首先用DNaseI处理待测样品，以除去待测样品中不被病毒衣壳包裹的游离核酸，可进一步提高检测的准确性。
[0009]第一方面，提供了检测rcAAV5的引物和探针组合，其中包括SEQ ID No.2和3所示的靶序列的扩增引物序列，以及SEQ ID No.4所示的靶序列的探针序列。
[0010]在一些实施方案中，所述引物和探针组合还包括SEQ ID No.6和7所示的内参序列的扩增引物序列，以及SEQ ID No.8所示的内参序列的探针序列。
[0011]在本文中，所述引物和探针组合用于检测rAAV5中污染物rcAAV5。探针序列的两端分别连接有荧光基团和淬灭基团，例如在3
’
端连接有淬灭基团而5
’
端连接有荧光基团。所述靶基因和内参基因的荧光基团可以为FAM、VIC、TAMRA、CY5等；所述靶基因的淬灭基团可以为MGB
‑
NFQ；所述内参基因的淬灭基团可为BHQ1、BHQ2、BHQ3等。
[0012]在一些实施方案中，其中SEQ ID No.4在5
’
端连接有FAM，3
’
端连接有MGB
‑
NFQ；SEQ ID No.8在5
’
端连接有CY5，3
’
端连接有BHQ3。
[0013]第二方面，提供了一种试剂盒，其包括第一方面所述的引物和探针组合。
[0014]在一些实施方案中，所述试剂盒还包括定量参考品，所述定量参考品可以包括例如SEQ ID NO.17所示的序列。更具体地，所述定量参考品可以为包含SEQ ID NO.17所示序列的线性化质粒。
[0015]在一些实施方案中，所述试剂盒还包括qPCR聚合酶，DNA稀释液(例如TE缓冲液)，以及定量参考品。在所述试剂盒中，内参和靶基因的引物、探针可以以预混液的形式存在。
[0016]再一方面，还提供了第一方面的引物和探针组合在制备试剂盒中的用途，其中所述试剂盒用于检测rAAV5中rcAAV5的污染率。
[0017]本领域已知，广义上来讲，rcAAV包括经过非同源重组的rcAAV和野生型AAV(wtAAV)。因此，本文对rcAAV5的检测也包括wtAAV5的检测。
[0018]再一方面，还提供了一种利用第一方面的引物和探针组合或第二方面的试剂盒检测rAAV5中rcAAV5的污染率的方法，包括步骤：
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.检测rcAAV5的引物和探针组合，其中包括SEQ ID No.2和3所示的靶序列的扩增引物序列，以及SEQ ID No.4所示的靶序列的探针序列。2.根据权利要求1所述的引物和探针组合，其中还包括SEQ ID No.6和7所示的内参序列的扩增引物序列，以及SEQ ID No.8所示的内参序列的探针序列。3.根据权利要求1或2所述的引物和探针组合，其中所述探针序列的两端分别连接有荧光基团和淬灭基团。4.根据权利要求3所述的引物和探针组合，其中所述荧光基团是FAM、VIC、TAMRA或CY5，所述淬灭基团是MGB
‑
NFQ、BHQ1、BHQ2或BHQ3。5.根据权利要求3所述的引物和探针组合，其中SEQ ID No.4在5
’
端连接有FAM，3
’
端连接有MGB
‑
NFQ；SEQ ID No.8在5
’
端连接有CY5，3
’
端连接有BHQ3。6.一种试剂...

【专利技术属性】
技术研发人员：张琪梦，杨志行，宗伟英，卢双红，
申请(专利权)人：湖州申科生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：