本发明专利技术公开了一种提高HCP检测抗体覆盖率的抗体组合及其应用。所述抗HCP抗体组合使用抗原分别免疫动物后制备得到；所述抗原包括低免疫原性HCP。本发明专利技术通过分级HCP免疫的方法进行抗体的制备，通过抗体配比组合优化，使得检测方法获得较高的检测灵敏度，同时满足高覆盖率要求。利用本发明专利技术的抗HCP抗体组合可尽可能多地识别含有大量蛋白分子的HCP抗原。多地识别含有大量蛋白分子的HCP抗原。
【技术实现步骤摘要】
一种提高HCP检测抗体覆盖率的抗体组合及其应用
[0001]本专利技术属于检测领域，具体涉及一种提高HCP检测抗体覆盖率的方法。
技术介绍
[0002]在传统化学药物开发难度及成本越来越大的形势下，目前，由于生物技术类药物的诸多优势，其在全球范围内已得到迅猛的发展。生物技术类药物种类较多，包括重组蛋白类药物，例如单抗，重组蛋白疫苗等；细胞及基因治疗药物(cell and gene therapy，CGT)，例如CAR
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T，溶瘤病毒等；mRNA治疗技术，例如mRNA疫苗等。这些生物技术类药物的生产工艺比较复杂，会引入较多的杂质，对药物的质量产生潜在的负面影响，因此监管层对生物技术类药物的质量控制也提出了更高的要求。
[0003]目前生物技术类药物始终需要通过工程类细胞，如细菌、酵母或哺乳动物、昆虫或植物细胞系等，来进行原料的生产。经典的重组蛋白表达技术已在许多生物制药产品中得到广泛的应用，主要采用宿主细胞进行外源蛋白质的表达和修饰。CGT药物生产关键物料，如质粒，也是在大肠杆菌中扩增纯化获取。基因治疗的假病毒载体需要在HEK293等细胞内重新合成组装。在这类产品的生产过程中，宿主细胞来源的蛋白质(host cell proteins，HCP)会不可避免地被引入到生产工艺流程中，从而产生最终药品中HCP的残留风险。科学研究已发现生物制药产品中残留HCP的主要危害是其有诱导机体产生抗HCP抗体的可能性，这些抗体可能会引起患者产生临床症状。此外，HCP可能作为免疫佐剂，诱导产生抗药抗体，影响药物安全性或有效性，因此全球各个国家的监管机构对HCP残留都有严格的限量要求。
[0004]目前，HCP的分析检测方法较多，其中HCP ELISA方法由于其操作方便快捷，成本较低，检测通量较高等优点，已被监管机构和企业广泛运用于纯化工艺开发和原液的放行检中。HCP ELISA检测方法原理是采用多克隆抗体的双抗体夹心法，其中关键点之一是采用的多克隆抗体能识别尽可能多的HCP，即高覆盖率，否则会导致漏检的风险。高覆盖率的HCP抗体是HCP ELISA检测方法验证的关键参数之一。由于HCP是多种蛋白质的复合物，分子量从5kDa到250kDa，等电点在3
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11区间，常规方法制备的抗体覆盖率往往不够理想，并且直接导致实际样本的检测适用性低，漏检的风险高。
技术实现思路
[0005]为了克服上述样本检测适用性低、覆盖率低，且检测灵敏度、检测效率不高的缺陷，本专利技术提供一种提高HCP检测抗体覆盖率的方法。
[0006]本方法是针对HCP抗原，其含有上千种以上的蛋白分子，如何使获得的多克隆抗体尽可能多地识别这些HCP抗原是目前需要解决的关键问题。从动物产生抗体的免疫学原理来理解，需要合适的抗原量，免疫周期和途径等方面进行优化。并且抗原本身分子量大小也会影响抗体的产生。因此，用总的HCP抗原免疫会导致对某些HCP抗原的免疫反应较弱，无法获得抗体。
[0007]本专利技术通过将低分子量分离，提升对低分子量HCP抗原的免疫反应。通过将HCP抗
原中高丰度或高分子的容易产生抗体和HCP抗原分离，加强对免疫原性低的抗原的免疫反应。
[0008]为了解决现有技术的缺陷，本专利技术第一方面提供一种抗HCP抗体组合，使用抗原分别免疫动物后制备得到各抗体的组合；所述抗原包括低免疫原性HCP，优选还包括以下抗原中的一种或多种：宿主细胞总HCP(host cell proteins)、低分子量HCP和高分子量HCP所述宿主细胞为原核细胞或真核细胞；优选所述真核细胞为CHO细胞，所述原核细胞为大肠杆菌，所述大肠杆菌例如为Escherichia coli。
[0009]在某些实施例中，所述低免疫原性HCP为所述宿主细胞总HCP经纯化得到的产物，和/或，所述低分子量HCP为分子量小于55KDa例如小于50KDa的HCP，例如分子量为：10KDa≤分子量<55KDa，和/或，所述高分子量HCP为分子量高于55KDa例如高于60KDa的HCP，例如分子量为：55KDa≤分子量≤250KDa；和/或，所述动物为哺乳动物优选羊例如绵羊。
[0010]在某些实施例中，所述抗原包括宿主细胞总HCP、低分子量HCP和低免疫原性HCP，或宿主细胞总HCP、低分子量HCP、高分子量HCP和低免疫原性HCP；由此得到的抗HCP抗体组合包括抗低免疫原性HCP抗体、抗总HCP抗体和抗低分子量HCP抗体，或抗低免疫原性HCP抗体、抗总HCP抗体、抗低分子量HCP抗体和抗高分子量HCP抗体。
[0011]在某些实施例中，获得所述宿主细胞总HCP的步骤包括：
[0012](1)将宿主细胞例如E.coli BL21的菌溶液与裂解溶液混合例如以1:10的比例混合，混匀，获得混合菌液；所述菌溶液例如利用宿主细胞菌体与水混合而成；
[0013](2)将所述混合菌液破碎后获得破碎菌液；
[0014](3)将所述破碎菌液离心后获得的上清液即为宿主细胞总HCP；或，
[0015]所述宿主细胞总HCP通过以下步骤获得：将所述宿主细胞进行浓缩例如使用PEG20000进行浓缩，即得。
[0016]优选地，步骤(1)中，所述裂解溶液是由0.2M NaHCO3溶液和蛋白酶抑制剂混合而得，pH为8.0
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9.0例如为8.3；
[0017]步骤(2)中，所述破碎的压力为1000
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1500bar例如1200bar，和/或，所述破碎的温度为10℃；所述破碎使用可细胞破碎仪等本领域常用的破碎仪器。
[0018]步骤(3)中，所述离心的速度为10000
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15000g例如12000g，和/或，所述离心的温度为4℃。
[0019]在某些实施例中，所述低分子量HCP的制备方法为将所述宿主细胞总HCP经分子筛层析获得洗脱液，所述洗脱液即为所述低分子量HCP。
[0020]优选地，所述分子筛层析的步骤包括：进行平衡、进样、洗脱和收集洗脱液。
[0021]更优选地，所述平衡和洗脱使用的溶液为0.2M NaHCO3溶液，和/或，
[0022]所述分子筛层析使用HiLoad 16/600Superdex 200pg层析柱；和/或，
[0023]所述洗脱液还进行了浓缩。
[0024]在某些实施例中，所述低免疫原性HCP由所述宿主细胞总HCP经FPLC纯化获得。
[0025]优选地，所述FPLC的步骤包括：
[0026]所述宿主细胞总HCP经过滤例如0.22μm滤膜过滤后上样，洗脱并收集洗脱液，即得所述低免疫原性HCP。
[0027]更优选地，所述FPLC的流动相为：流动相A：PBS，pH 7.4，收集流穿液；
[0028]切换流动相B：0.075％ PBST，pH 7.4；
[0029]切换流动相C：0.1M Gly
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HCl，pH 2.5。
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【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种抗HCP抗体组合，其特征在于，使用抗原分别免疫动物后制备得到各抗体的组合；所述抗原包括低免疫原性HCP，优选还包括以下抗原中的一种或多种：宿主细胞总HCP、低分子量HCP和高分子量HCP；所述宿主细胞为原核细胞或真核细胞；优选所述真核细胞为CHO细胞，所述原核细胞为大肠杆菌，所述大肠杆菌例如为Escherichia coli。2.如权利要求1所述的抗HCP抗体组合，其特征在于，所述低免疫原性HCP为所述宿主细胞总HCP经纯化得到的产物，和/或，所述低分子量HCP为分子量小于55KDa例如小于50KDa的HCP，和/或，所述高分子量HCP为分子量高于55KDa例如高于60KDa的HCP；和/或，所述动物为哺乳动物优选羊例如绵羊。3.如权利要求1或2所述的抗HCP抗体组合，其特征在于，所述抗原包括宿主细胞总HCP、低分子量HCP和低免疫原性HCP，或宿主细胞总HCP、低分子量HCP、高分子量HCP和低免疫原性HCP；由此得到的抗HCP抗体组合包括抗低免疫原性HCP抗体、抗总HCP抗体和抗低分子量HCP抗体，或抗低免疫原性HCP抗体、抗总HCP抗体、抗低分子量HCP抗体和抗高分子量HCP抗体。4.如权利要求1～3任一项所述的抗HCP抗体组合，其特征在于，获得所述宿主细胞总HCP的步骤包括：(1)将宿主细胞例如E.coliBL21的菌溶液与裂解溶液混合例如以1:10的比例混合，混匀，获得混合菌液；所述菌溶液例如利用宿主细胞菌体与水混合而成；(2)将所述混合菌液破碎后获得破碎菌液；(3)将所述破碎菌液离心后获得的上清液即为宿主细胞总HCP；或，所述宿主细胞总HCP通过以下步骤获得：将所述宿主细胞进行浓缩例如使用PEG20000进行浓缩，即得；优选地，步骤(1)中，所述裂解溶液是由0.2M NaHCO3溶液和蛋白酶抑制剂混合而得，pH为8.0
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9.0例如为8.3；步骤(2)中，所述破碎的压力为1000
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1500bar例如1200bar，和/或，所述破碎的温度为10℃；步骤(3)中，所述离心的速度为10000
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15000g例如12000g，和/或，所述离心的...
【专利技术属性】
技术研发人员：豆敏华，杨志行，陈秋燕，郭文文，
申请(专利权)人：湖州申科生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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