检测牛源DNA的引物及检测方法技术

本发明专利技术提供了检测牛基因组DNA的引物对、包含本发明专利技术引物对的检测试剂或试剂盒以及利用所述引物对检测牛基因组DNA的方法，所述引物对特异性结合于SEQ ID NO:1所示序列。利用所述引物对的PCR检测方法操作简便快捷、灵敏度高、能区分猪、CHO、Vero、人、NS0、MDCK、E.coli、毕赤酵母和Sf9等干扰性DNA。毕赤酵母和Sf9等干扰性DNA。

【技术实现步骤摘要】
检测牛源DNA的引物及检测方法


[0001]本专利技术涉及生物检测领域。具体地说，本专利技术涉及检测生物材料中牛源DNA残留的引物及检测方法。

技术介绍

[0002]动物源性细胞外基质组成的生物支架具有免疫原性低，生物相容性好等特点，已经广泛应用于临床肌腱、皮肤、心血管和胃肠道等组织再生修复和重建手术。这些细胞外基质主要来源于人和其他哺乳动物的组织和器官，包括真皮，膀胱，心脏瓣膜和心包膜等。由于人体组织的可用性有限，一些哺乳动物如牛的组织被大量用于制造细胞外基质材料。
[0003]在生物源医疗器械的制造过程中，来源于牛组织器官的细胞外基质中可能有牛源DNA残留，残留的DNA被认为具有潜在的危害性并可能导致异种生物材料植入过程中出现生物相容性问题或引起炎症反应等。脱细胞技术可用于去除组织中主要的细胞成分，降低免疫原性风险，并保留天然的三维空间结构。但现有的脱细胞技术不能完全去除所有细胞成分和核酸的残留，因此通过定量检测细胞组分如双链DNA的残留量是控制和降低动物源性生物材料免疫原性风险的重要措施。
[0004]实时荧光定量PCR技术利用特异性荧光标记的Taqman探针可以对样本中残留DNA进行定量检测分析，带有荧光基团的探针在热循环过程中不断激发荧光信号，通过监测积累的荧光信号的变化反映PCR过程中产物的增加，从而实现对样本中的DNA进行定量分析。基于Taqman探针的定量PCR检测技术具有特异性好、准确性高和速度快等优势。
[0005]现有的研究大多集中在肉类、饲料、明胶等食品掺假及鉴别上，且已有的关于牛源DNA鉴定的qPCR靶标序列都是单拷贝基因或线粒体基因，这些基因的拷贝数低或在细胞中不恒定，可能会导致灵敏度低，存在定量偏差和假阴性情况。对于医疗器械的风险安全控制，牛源残留DNA的控制更加严格，这就要求检测技术的灵敏度更高。因此，医疗器械领域亟需更高标准的牛源DNA残留定量检测方法。
[0006]高度重复序列在基因组中具有拷贝数高，分布广等特点，基于牛高度重复序列靶标的qPCR方法具有更高的检测灵敏度和准确性，适用于对生物医疗器械中痕量残留DNA进行精确定量分析。验证后的检测方法用于医疗器械生产流程中安全控制，避免患者在使用过程中出现潜在的风险。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的是提供一种高灵敏度，高特异性地检测生物材料中牛源DNA残留的引物对，以及包含所述引物对的检测试剂或PCR试剂盒。
[0008]本专利技术的另一目的是提供利用本专利技术提供的引物对或检测试剂检测生物材料中牛源DNA残留的方法或PCR方法。
[0009]在第一方面，本专利技术提供一种检测牛基因组DNA的引物对，所述引物对包括正向引物和反向引物，其中所述正向引物结合于牛基因组DNA上SEQ ID NO:1所示序列的第90
‑
125
位，优选第99
‑
118位；其中的反向引物结合于牛基因组DNA上SEQ ID NO:1所示序列的第210
‑
245位，优选第218
‑
236位；并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为138
‑
156bp。
[0010]在优选的实施方式中，所述正向引物和反向引物的长度为16～22bp；优选20bp。
[0011]在优选的实施方式中，所述正向引物和反向引物的Tm温度为60～61℃，并且正向引物的Tm与反向引物的Tm的差值的绝对值≤1℃。
[0012]在具体的实施方式中，所述引物对中，所述正向引物如SEQ ID NO:2所示，所述反向引物如SEQ ID NO:3所示。
[0013]在第二方面，本专利技术提供一种检测试剂，所述检测试剂包含第一方面所述的引物对。
[0014]在优选的实施方式中，所述检测试剂还包含探针。
[0015]在优选的实施方式中，所述探针如SEQ ID NO:4所示。
[0016]在第三方面，本专利技术提供一种检测试剂盒，所述检测试剂盒包含第一方面所述的引物对或第二方面所述的检测试剂，还任选包含利用所述引物对或检测试剂检测牛源DNA的使用说明书。
[0017]在具体的实施方式中，所述检测试剂还包含探针。
[0018]在优选的实施方式中，所述探针如SEQ ID NO:4所示。
[0019]在具体的实施方式中，所述引物对中正向引物如SEQ ID NO:2所示，所述反向引物如SEQ ID NO:3所示，所述探针如SEQ ID NO:4所示。
[0020]在优选的实施方式中，所述检测试剂的检测灵敏度为5fg/反应。
[0021]在第四方面，本专利技术提供一种检测牛基因组DNA的方法，所述方法包括：利用第一方面所述的引物对或第二方面所述的检测试剂或第三方面所述的检测试剂盒，对待测样品进行PCR，并检测PCR扩增产物。
[0022]在第五方面，本专利技术提供一种PCR试剂盒，所述试剂盒中包括容器以及位于所述容器中的第一方面所述的引物对。
[0023]在优选的实施方式中，所述正向引物和反向引物的长度为16～22bp；优选20bp。
[0024]在优选的实施方式中，所述正向引物和反向引物的Tm温度为60～61℃，并且正向引物的Tm与反向引物的Tm的差值的绝对值≤1℃。
[0025]在优选的实施方式中，所述试剂盒中还装有探针。
[0026]在优选的实施方式中，所述探针如SEQ ID NO:4所示。
[0027]在优选的实施方式中，所述检测试剂的检测灵敏度为5fg/反应。
[0028]在优选的实施方式中，所述试剂盒中还装有标准品对照。
[0029]在第六方面，本专利技术提供一种PCR方法，包括步骤：
[0030]在一PCR检测体系中，利用第一方面所述的引物对扩增目标产物。
[0031]在优选的实施方式中，所述正向引物和反向引物的长度为16～22bp；优选20bp。
[0032]在优选的实施方式中，所述正向引物和反向引物的Tm温度为60～61℃，并且正向引物的Tm与反向引物的Tm的差值的绝对值≤1℃。
[0033]在优选的实施方式中，所述试剂盒中还装有探针。
[0034]在优选的实施方式中，所述探针如SEQ ID NO:4所示。
[0035]在第七方面，本专利技术提供第一方面所述的引物对或第二方面所述的检测试剂或第三方面所述的检测试剂盒的用途，用于检测待测对象中是否存在牛基因组DNA。
[0036]在优选的实施方式中，所述待测对象是牛源细胞外基质；优选来源于牛的真皮、膀胱、心脏瓣膜和心包膜的细胞外基质；更优选来源于牛的口腔修复膜和硬脑(脊)修复膜、胶原蛋白、眼科植入角膜、人工皮肤、医用缝合材料等。
[0037]应理解，在本专利技术范围内中，本专利技术的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
[0038本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测牛基因组DNA的引物对，所述引物对包括正向引物和反向引物，其中所述正向引物结合于牛基因组DNA上SEQ ID NO:1所示序列的第90
‑
125位，优选第99
‑
118位；其中的反向引物结合于牛基因组DNA上SEQ ID NO:1所示序列的第210
‑
245位，优选第218
‑
236位；并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为138
‑
156bp。2.如权利要求1所述的引物对，其特征在于，所述引物对中，所述正向引物如SEQ ID NO:2所示，所述反向引物如SEQ ID NO:3所示。3.一种检测试剂，所述检测试剂包含权利要求1或2所述的引物对。4.一种检测试剂盒，所述检测试剂盒包含权利要求1或2所述的引物对或权利要求3所述的检测试剂，还任选包含利用所述引物对或检测试剂检测牛源DNA的使用说...

【专利技术属性】
技术研发人员：邵安良，吴婉欣，陈亮，宗伟英，李康凯，吴晓双，魏利娜，段晓杰，范行良，陈丽媛，张潇，徐丽明，李静莉，
申请(专利权)人：湖州申科生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：