一种快速检测桑尼短体线虫的RPA引物、试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术公开了一种快速检测桑尼短体线虫的RPA引物、试剂盒及检测方法，涉及生物技术领域。本发明专利技术通过比对桑尼短体线虫的不同基因区段进行引物的设计筛选，获得特异性RPA引物，利用Basic RPA试剂盒进行反应，反应产物通过琼脂糖凝胶电泳检测。若电泳结果出现277bp的特异性条带，则待测线虫为桑尼短体线虫，反之则无，可以高效、快速、便捷、准确的获得检测结果，为早期田间预测预报和防控提供技术支持，同时操作简单，不依赖昂贵的精密仪器和专业技术背景，为基层人员使用提供了便利。为基层人员使用提供了便利。为基层人员使用提供了便利。

【技术实现步骤摘要】
一种快速检测桑尼短体线虫的RPA引物、试剂盒及检测方法


[0001]本专利技术涉及生物
，更具体的说是涉及一种快速检测桑尼短体线虫的RPA引物、试剂盒及检测方法。

技术介绍

[0002]短体线虫(Pratylenchus spp.)对全球作物的危害程度仅次于根结线虫(Meloidogyne)和孢囊线虫(Heterodera)，是世界上第三大植物病原线虫。短体线虫的寄主众多，地理分布广泛，在全世界范围内广泛发生危害。短体线虫属于迁徙性植物内寄生线虫，在整个生命周期中都存在迁移。短体线虫侵染寄生植物，一般采用口针穿刺取食根系表皮，造成机械损伤，严重时能造成植物根系的功能丧失及坏死腐烂。短体线虫侵染寄生植物所造成的机械损伤，为真菌、细菌等其它病原物的侵染提供了便利，从而造成复合侵染现象的发生，给农业造成更大损失。桑尼短体线虫(P.thornei)是危害最为严重的短体线虫之一，在我国发生普遍，严重危害多种粮食作物和经济作物。植物线虫体型微小，大多为土传病害，一般难以发现，且造成植物根系的受害症状与很多真菌病害难以区分。因此，桑尼短体线虫的快速准确检测，对于农业生产和检疫工作具有重要意义，对于作物抗病品种的选育和病害的防治也有重要的意义。
[0003]传统的短体线虫鉴定多采用形态学鉴定，主要通过显微镜观察线虫的形态特征和形态结构的测量值。线虫形态学特征包括内部特征和外部特征。内部特征是线虫的生殖系统和消化系统等的结构特征；外部特征是线虫的体长、头部、尾部等的形态特征。形态学鉴定是线虫分类鉴定的基础，也是线虫分类鉴定的重要特征。但是由于不同的人之间操作的不同，经常导致线虫的形态测量出现误差。形态学鉴定对于操作人员的专业要求较高，耗时较长，所以在鉴定植物病原线虫时会辅助其他方法。随着分子生物学的快速发展，线虫的分类鉴定常常与分子鉴定相结合，以达到准确快速的鉴别线虫种类的目的。但目前所广泛应用的分子检测技术操作复杂、对精密仪器依赖性高、对操作人员专业素质要求高。因此，开发一种准确、高效、操作简便、对仪器设备和人员要求低的的桑尼短体线虫的快速检测技术在作物的大田生产中具有重要的意义。
[0004]重组酶聚合酶扩增技术(RPA)的原理是重组酶和引物形成复合物；复合物识别模版同源序列；双链打开，复合物入侵；单链结合蛋白和打开的单链DNA结合防止降解；在DNA聚合酶的作用下引物链延长；两个相反引物通过结合延伸过程形成除模版外另一条完整扩增产物。多次重复该过程使DNA指数扩增。目前尚未见RPA技术应用于快速检测短体线虫等的报道。
[0005]因此，能否提供一种快速检测桑尼短体线虫的RPA引物、试剂盒及检测方法是本领域技术人员亟需解决的问题。

技术实现思路

[0006]有鉴于此，本专利技术提供了一种快速检测桑尼短体线虫的RPA引物、试剂盒及检测方
法。具有显著的优越性：1.便捷：反应为恒温扩增，对设备要求低，对精密仪器依赖性低，只需要一个恒温加热仪器即可完成。2.快速：反应可在20分钟完成检测。3.操作简单：只需要一对引物即可进行反应。4.灵敏性高：可检测到单分子核酸水平。
[0007]为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0008]一种用于检测桑尼短体线虫的RPA引物，RPA引物的核苷酸序列如下：正向引物
‑
Pt
‑
RPAF1：5
′‑
TGAAAACGAAAAATTCTAGCCTTATCGGTG
‑3′
，如SEQ ID NO.1；
[0009]反向引物
‑
Pt
‑
RPAR1：5
′‑
TTCATATGTTTGTATGCGAATTCAACTGAT
‑3′
，如SEQ ID NO.2。
[0010]本专利技术还提供了一种基于上述引物的试剂盒。
[0011]优选的：试剂盒组分包括：再水化缓冲液，无酶水，醋酸镁，RPA冻干酶粉。
[0012]优选的：反应体系如下：
[0013]再水化缓冲液29.5μL，无酶水11.2μL，醋酸镁2.5μL，10μM的上游引物和下游引物各2.4μL，DNA模板2μL，RPA冻干酶粉5mg。
[0014]优选的：反应条件如下：金属浴40℃中20分钟，随后在冰上结束反应。
[0015]本专利技术还提供了上述的引物在制备检测桑尼短体线虫试剂盒的应用。
[0016]本专利技术还提供了上述的引物或上述任一的试剂盒在检测桑尼短体线虫上的应用。
[0017]本专利技术还提供了基于上述试剂盒快速检测桑尼短体线虫的方法，包括以下步骤：
[0018](1)提取待测样品的DNA；
[0019](2)以步骤(1)所提取的DNA作为RPA反应的模板，采用引物，进行RPA反应扩增，获得RPA反应产物；
[0020](3)对步骤(2)获得的RPA反应产物进行纯化，用琼脂糖凝胶电泳进行产物分析。
[0021]优选的：步骤(3)分析的标准：若在277bp处出现扩增条带则为桑尼短体线虫。
[0022]经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本专利技术公开提供了一种快速检测桑尼短体线虫的RPA引物、试剂盒及检测方法，取得的技术效果为：
[0023]本专利技术基于重组酶聚合酶扩增方法，利用蛋白酶K法获取待测线虫样本的DNA。配置RPA反应体系，使用TwistAmp
TM
Basic Kit试剂盒进行反应，将RPA反应管置于40℃金属浴反应20min后于冰上停止。纯化回收RPA反应产物，利用琼脂糖凝胶电泳分析扩增产物。
[0024]通过比对桑尼短体线虫的不同基因区段进行引物的设计筛选，获得特异性RPA引物，利用Basic RPA试剂盒进行反应，反应产物通过琼脂糖凝胶电泳检测。若电泳结果出现277bp的特异性条带，则待测线虫为桑尼短体线虫，反之则无。利用本专利技术的检测方法可以高效、快速、便捷、准确的获得检测结果，为早期田间预测预报和防控提供技术支持，同时该本技术操作简单，不依赖昂贵的精密仪器和专业技术背景，为基层人员使用提供了便利。
附图说明
[0025]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
[0026]图1附图为本专利技术提供的桑尼短体线虫RPA引物的特异性检测图，其中，M：DL2000 Marker；1～5指的是咖啡短体线虫5个种群的检测结果，6～10指的是斯克里布纳短体线虫5
个种群的检测结果，11～15指的是桑尼短体线虫5个群体的检测结果，16指的是腐烂茎线虫的检测结果，17指的是落选短体线虫的检测结果，18指的是饰环矮化线虫的检测结果，19指的是小叶螺旋线虫的检测结果，20指的是水稻干尖线虫的检测结果，CK是指ddH2O本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于检测桑尼短体线虫的RPA引物，其特征在于：所述RPA引物的核苷酸序列如下：正向引物
‑
Pt
‑
RPAF1：5
′‑
TGAAAACGAAAAATTCTAGCCTTATCGGTG
‑3′
，如SEQ ID NO.1；反向引物
‑
Pt
‑
RPAR1：5
′‑
TTCATATGTTTGTATGCGAATTCAACTGAT
‑3′
，如SEQ ID NO.2。2.一种基于权利要求1所述引物的试剂盒。3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒组分包括：再水化缓冲液，无酶水，醋酸镁，RPA冻干酶粉。4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，反应体系如下：再水化缓冲液29....

【专利技术属性】
技术研发人员：王珂，李宇，李洪连，赵湘媛，袁虹霞，孙炳剑，李永辉，
申请(专利权)人：河南农业大学，
类型：发明
国别省市：