一种高产制造技术

本发明专利技术涉及基因工程技术领域，公开了一种高产

【技术实现步骤摘要】
一种高产D
‑
泛酸的基因工程菌及其构建方法与应用


[0001]本专利技术涉及基因工程
，尤其涉及一种高产
D
‑
泛酸的基因工程菌及其构建方法与应用
。

技术介绍

[0002]在生物体中，泛酸是酰基载体蛋白和乙酰辅酶
A
生物合成的重要前体
。
除此之外泛酸可以在泛酸激酶和丙酮酸脱氢酶的催化下转化为乙酰辅酶
A
，为细胞的三羧酸循环提供重要的底物
。
同时，泛酸还在组蛋白的乙酰化以及碳水化合物和脂肪酸等许多物质的合成代谢和分解代谢途径中发挥核心作用，以此协助细胞正常功能的行使
。
另外，泛酸在对抗压力
、
维护头发
、
皮肤及血液健康方面也有重要作用，还有助于体内抗压荷尔蒙的分泌，并且也可以保持皮肤和头发的健康等
。
[0003]作为泛酸及其衍生物的产品在多个领域都具有广泛的应用
。
在医药领域中，泛酸具有制造抗体的功能，泛酸产品外用还可以治疗多种皮肤病，如鱼鳞病
、
银屑病
、
接触性皮炎等；泛酸在动物饲料方面多用作维生素添加剂，添加于家禽
、
猪
、
幼龄反刍动物
、
鱼类等的饲料中，其有助于动物的生长发育
、
脂肪的合成和分解
、
能够改善动物毛发
、
羽毛
、
鳞片等的色泽；泛酸在化妆品
、
护肤品里主要作用是保湿剂，皮肤调理剂，具有舒缓抗敏的作用，比较安全
。
[0004]D
‑
泛酸
(PantothenicAcid)
又称为
D
‑
泛酸钙
、
维生素
B5
，是一种水溶性维生素
。D
‑
泛酸的生产方法目前主要有物理诱导结晶法
、
化学拆分法
、
化学合成法
、
生物法等
。
物理诱导结晶工艺比较成熟，其原理是将混旋的
D
型和
L
型的泛酸钙的溶解度大于单一型的泛酸钙的原理，进行诱导结晶，但此方法只能单纯生产泛酸钙，不能用于泛酸的衍生产品，应用面较窄
。
化学拆分法是目前应用最多的生产方法，化学拆分法是利用手性拆分剂进行拆分得到
D
‑
泛酸，但其也存在拆分后分离困难
、
剩余反应液处理难
、
手性拆分剂价格昂贵等一系列问题
。
而化学合成法则是利用泛酸的两个前体
β
‑
丙氨酸与
D
‑
泛解酸内酯反应得到
D
‑
泛酸，但此方法生产
D
‑
泛酸时对设备要求较高，前体合成过程中会产生有毒物质，不符合绿色发展需求
。
[0005]利用生物发酵法生产
D
‑
泛酸产品，可以利用葡萄糖等廉价的工业原料
、
经过生物体自身代谢反应而得到
D
‑
泛酸产品
。
生物发酵法利用廉价原料得到高附加值的产物不仅符合发展利益减少生产成本，还具有环境代价小，生产效率高等优点
。
但生物发酵法存在发酵过程不稳定
、
产量不高等问题
。

技术实现思路

[0006]为了解决上述生物发酵法生产
D
‑
泛酸发酵过程不稳定
、
产量不高的技术问题，本专利技术提供了一种高产
D
‑
泛酸的基因工程菌及其构建方法与应用
。
本专利技术通过改造枯草芽孢杆菌代谢途径，强化泛酸合成前体
β
‑
丙氨酸的合成
、
并减少
β
‑
丙氨酸前体支路代谢流，最终使得加强
β
‑
丙氨酸的积累，进一步地，最终使得
D
‑
泛酸的产量增加
。
[0007]本专利技术的具体技术方案为：首先，本专利技术提供了一种高产
D
‑
泛酸的基因工程菌
。
该高产
D
‑
泛酸的基因工程菌以枯草芽孢杆菌为底盘菌构建，其构建方法包括以下步骤：
(1)
过表达底盘菌基因组中的
panD、panC、aspB
基因；
(2)
敲除底盘菌基因组中的
nadB、gabT
基因；
(3)
在底盘菌中异源表达来源于大肠杆菌的
ppC、aspC、aspA、panD
基因；
(4)
在底盘菌中异源表达来源于谷氨酸棒杆菌的
panC
基因
。
[0008]D
‑
泛酸的合成前体物质主要是泛解酸内酯和
β
‑
丙氨酸
。
在
β
‑
丙氨酸合成途径中，糖酵解后得到磷酸烯醇式丙酮酸，接着，磷酸烯醇式丙酮酸在磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的作用下合成草酰乙酸，然后草酰乙酸生成天冬氨酸，天冬氨酸转变为
β
‑
丙氨酸
。
在
D
‑
泛酸的合成途径中，前体
β
‑
丙氨酸是影响
D
‑
泛酸产量的一个重要因素
。
本专利技术以枯草芽孢杆菌为底盘菌，通过“过表达底盘菌的
panD、panC、aspB
基因，敲除底盘菌的
nadB、gabT
基因，在底盘菌中异源表达来源于大肠杆菌的
ppC、aspC、aspA、panD
基因，在底盘菌中异源表达来源于谷氨酸棒杆菌的
panC
基因”，可以通过改造
β
‑
丙氨酸合成途径，使得枯草芽孢杆菌改造后在无需添加
β
‑
丙氨酸的条件下即可高效生产
D
‑
泛酸
。
具体地，改造原理为：本专利技术通过：
(1)
引入大肠杆菌外源
ppC
和
aspC
基因加强磷酸烯醇式丙酮酸直接转化为草酰乙酸然后转化为
L
‑
天冬氨酸，加强
β
‑
丙氨酸代谢途径的前体积累；
(2)
强化
D
‑
泛酸合成途径中关键基因
panD、panC、aspB
基因的表达，加强
L
‑
天冬氨酸到
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种高产
D
‑
泛酸的基因工程菌，其特征在于：以枯草芽孢杆菌为底盘菌构建，其构建方法包括以下步骤：
(1)
过表达底盘菌基因组中的
panD、panC、aspB
基因；
(2)
敲除底盘菌基因组中的
nadB、gabT
基因；
(3)
在底盘菌中异源表达来源于大肠杆菌的
ppC、aspC、aspA、panD
基因；
(4)
在底盘菌中异源表达来源于谷氨酸棒杆菌的
panC
基因
。2.
如权利要求1所述的基因工程菌的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤
S1
：以枯草芽孢杆菌为底盘菌，将大肠杆菌来源的
ppC
基因引入底盘菌基因组，得到工程菌
DPA1
；步骤
S2
：将大肠杆菌来源的
aspC
基因引入工程菌
DPA1
基因组，得到工程菌
DPA2
；步骤
S3
：过表达工程菌
DPA2
基因组中的
panD
基因，得到工程菌
DPA3
；步骤
S4
：过表达工程菌
DPA3
基因组中的
panC
基因，得到工程菌
DPA4
；步骤
S5
：过表达工程菌
DPA4
基因组中的
aspB
基因，得到工程菌
DPA5
；步骤
S6
：敲除工程菌
DPA5
基因组中的
nadB
基因，得到工程菌
DPA6
；步骤
S7
：在工程菌
DPA6
基因组中插入大肠杆菌来源...

【专利技术属性】
技术研发人员：柳志强，陈振杰，周俊平，谢琳，张博，黄良刚，郑裕国，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：