一种重组表达制造技术

本发明专利技术提供了一种重组表达

【技术实现步骤摘要】
一种重组表达Amuc_1631的乳酸乳球菌的构建方法及应用


[0001]本专利技术属于生物技术和基因工程
，特别涉及一种重组表达
Amuc_1631
的乳酸乳球菌的构建方法及应用
。

技术介绍

[0002]肥胖是一种由长期的能量摄入大于能量消耗导致的慢性代谢疾病
。
不仅表现为体重的增加，还与体内葡萄糖与脂肪的异常代谢
、
慢性炎症
、
各种疾病的患病几率增加有关，特别是糖尿病
、
心血管病与癌症
。
目前针对于肥胖的治疗方法主要是调整饮食与系统锻炼，然而这两种方法很难维持长期的体重减轻；减肥手术对严重肥胖十分有效，但高昂的手术费用及术后并发症
、
副作用导致其应用面十分狭窄
。
[0003]GLP
‑
1(glucagon
‑
like peptide
‑1，人胰高血糖素样肽
‑
1)
是一种由回肠末端内分泌
L
细胞分泌的，大小为
37
个氨基酸的多肽类肠道激素，由前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶
‑
kexin
‑1型
(proprotein convertase subtilisin
‑
kexin type 1
，
PCSK1)
对前胰高血糖素
(proglucagon
，
GCG)<br/>翻译修饰产生
。GLP
‑1生理功能众多，能够促进胰岛素的合成分泌
、
促进胰岛
‑
β
细胞的增殖
、
促进胃排空
、
调节食欲等，是目前研究降糖减脂的靶点之一
。
但
GLP
‑1在体内会很快被二肽基肽酶
(DPP
‑
IV)
分解导致其半衰期少于2分钟
。
[0004]Amuc_1631(P9)
是由嗜黏蛋白阿克曼菌
Akkermansia muciniphila
分泌的一种羧基末端蛋白酶，能够与
ICAM
‑2受体结合，刺激机体产生
GLP
‑1并上调脂肪组织解偶联蛋白
‑
1(uncouplingprotein 1
，
UCP
‑
1)
转录水平，诱导产热
。
目前重组表达
Amuc_1631
的策略是将大肠杆菌作为底盘细胞进行改造，该原核表达系统操作简单
、
成本较低，但将纯化蛋白这一步骤十分繁琐，而且大肠杆菌会产生内毒素
、
不能进行原位应用
,
，这限制了其在治疗医学的进一步应用
。

技术实现思路

[0005]针对现有技术中存在的问题，本专利技术的目的在于提供一种重组表达
Amuc_1631
的乳酸乳球菌的构建方法及应用，以乳酸乳球菌为出发菌
、
构建得到的重组表达
Amuc_1631
的乳酸乳球菌，能够在恶劣的胃肠道环境中生存并定植；更为重要的是乳酸乳球菌不含内毒素，能够直接服用并与重组表达的治疗因子
——P9
蛋白协同发挥益生作用
。
[0006]本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的：
[0007]本专利技术的第一方面提供了一种重组表达
Amuc_1631
的乳酸乳球菌的构建方法，包括以下步骤：
[0008]步骤1，
Amuc_1631
基因密码子的优化
[0009]按照乳酸乳球菌密码子偏好性
、
对
Amuc_1631
基因密码子进行优化，优化后的核苷酸序列如
SEQ ID No.1
所示；
[0010]在优化后的
Amuc_1631
基因密码子序列的
N
端，加入
Usp45
信号肽核苷酸序列，获得
Usp45
信号肽
—Amuc_1631
基因片段；
[0011]步骤2，重组质粒
pNZP9
的构建
[0012]S21
，
Usp45
信号肽
—Amuc_1631
基因片段的扩增：设计特异性引物组，利用
PCR
扩增所述
Usp45
信号肽
—Amuc_1631
基因片段；
[0013]S22
，构建重组质粒：使用
NcoI
和
HindIII
对质粒进行双酶切，将酶切后的质粒载体片段
、Usp45
信号肽
—Amuc_1631
基因片段混合
、
连接，形成重组质粒
pNZP9
；
[0014]步骤3，乳酸乳球菌重组菌株的制备
[0015]利用电转化法将步骤2构建得到的重组质粒
pNZP9
转化至乳酸乳球菌中，筛选得到阳性重组子，即为重组表达
Amuc_1631
的乳酸乳球菌
。
[0016]进一步的，步骤2中
S21
，所述特异性引物组包括：序列如
SEQ ID No.2
所示的上游引物，和序列如
SEQ ID No.3
所示的下游引物
。
[0017]进一步的，步骤2中
S21
，
PCR
反应的程序为：
95℃
预变性
5min
，
95℃
变性
30s
，
55℃
退火
30s
，
72℃
延伸
1min30 s
，
72℃
终延伸
5min
，共
30
个循环
。
[0018]进一步的，步骤3制备乳酸乳球菌重组菌株的具体步骤为：
[0019]S31
，重组质粒
pNZP9
电转化乳酸乳球菌：
[0020]取乳酸乳球菌感受态细胞
、
冰上融化，将感受态细胞与步骤2构建得到的重组质粒
pNZP9
轻弹混匀，将混合物转入预冷的电转化杯中进行电转化；电转化后，立即向混合物中加入复苏培养基，冰上静置后转入无菌离心管中培养；将培养获得的菌液涂布于含氯霉素的平板培养基中，培养
、
等待转化子生长；
[0021]S32
，菌落
PCR
鉴定阳离子
[0022]挑取转化子单菌落，利本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种重组表达
Amuc_1631
的乳酸乳球菌的构建方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：步骤1，
Amuc_1631
基因密码子的优化按照乳酸乳球菌密码子偏好性
、
对
Amuc_1631
基因密码子进行优化，优化后的核苷酸序列如
SEQ ID No.1
所示；在优化后的
Amuc_1631
基因密码子序列的
N
端，加入
Usp45
信号肽核苷酸序列，获得
Usp45
信号肽
—Amuc_1631
基因片段；步骤2，重组质粒
pNZP9
的构建
S21
，
Usp45
信号肽
—Amuc_1631
基因片段的扩增：设计特异性引物组，利用
PCR
扩增所述
Usp45
信号肽
—Amuc_1631
基因片段；
S22
，构建重组质粒：使用
NcoI
和
HindIII
对质粒进行双酶切，将酶切后的质粒载体片段
、Usp45
信号肽
—Amuc_1631
基因片段混合
、
连接，形成重组质粒
pNZP9
；步骤3，乳酸乳球菌重组菌株的制备利用电转化法将步骤2构建得到的重组质粒
pNZP9
转化至乳酸乳球菌中，筛选得到阳性重组子，即为重组表达
Amuc_1631
的乳酸乳球菌
。2.
根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤2中
S21
，所述特异性引物组包括：序列如
SEQ ID No.2
所示的上游引物，和序列如
SEQ ID No.3
所示的下游引物
。3.
根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤2中
S21
，
PCR
反应的程序为：
95℃
预变性
5min
，
95℃
变性
30s
，
55℃
退火
30s
，
72℃
延伸
1min30s
，
72℃
终延伸
5min
，共
30
个循环
。4.
根据权利要求1所述的构建方...

【专利技术属性】
技术研发人员：翟征远，郝彦玲，赵亮，狄文轩，张宇臣，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：