一种非诱导型制造技术

本发明专利技术公开了一种非诱导型

【技术实现步骤摘要】
一种非诱导型
β
‑
丙氨酸基因工程菌及其构建与应用
(一)

[0001]本专利技术涉及到一种利用大肠杆菌内源性启动子和
5'
非翻译区
(Promoter
‑
5'
‑
UTR)
构成的多重成对组装序列，对大肠杆菌
β
‑
丙氨酸合成途径的关键基因进行表达调控，以及该基因工程菌在微生物发酵制备
β
‑
丙氨酸中应用
。
(二)
技术介绍

[0002]β
‑
丙氨酸是
L
‑
天冬氨酸衍生氨基酸之一，虽然在生物体中不参与蛋白质的合成，但是在全球各个领域内都具有着重要的工业应用，在饲料添加剂
、
食品
、
医疗等领域具有非常重要的商业价值和较大的需求
。
[0003]β
‑
丙氨酸是自然界中唯一存在的一种
β
型氨基酸，是一种非天然氨基酸
。
与天然氨基酸相反，非天然氨基酸在微生物代谢过程中通常不能或只能极其低效地形成
。
化学合成法是目前大规模生产
β
‑
丙氨酸的主要方法，也是合成非天然氨基酸的典型方法
。
但由于反应条件苛刻，使用过程中或释放出高挥发性有毒物质，环境污染严重，且原料成本高，不符合国家绿色可持续化的工业化生产的标准，因此逐渐受到限制
。
另一方面，近年来，利用微生物细胞内酶与底物反应来合成
β
‑
丙氨酸已经成为学术界的热门话题
。
虽然这种技术已经取得了很大的进步，但由于其昂贵的原料以及反应条件的苛刻，仍然需要寻求更加环保
、
高效的微生物发酵技术来替代这种技术
。
微生物发酵法利用代谢工程
、
基因工程
、
分子生物学等技术，以廉价环保的生物质为原料，实现目标化学品的高效定向合成，为大规模工业生产带来巨大的商业利益
。
相比较于化学合成法和酶法合成
β
‑
丙氨酸，微生物发酵法具备反应条件相对温和
、
环境污染小
、
成本低以及可持续发展等优点
。
[0004]野生型的大肠杆菌只能合成满足自身生长代谢所需求
β
‑
丙氨酸的量，
β
‑
丙氨酸不会在体内大量积累，只有在经过有目的的代谢工程改造之后，大肠杆菌才能够用于工业生产大量
β
‑
丙氨酸
。
[0005]随着合成生物学和代谢工程的发展，越来越多的调控策略被建立
。
关于
β
‑
丙氨酸工程菌的代谢改造策略也有过很多的报道
。
为了将代谢通量集中在目标产物的方向，人们开发了各种合成生物学工具来平衡代谢通量
。
过表达或敲除等策略在很多情况下已经被成功利用，但随着对代谢工程的深入研究发现，过度修饰和干扰代谢途径不仅不能提高目标产物的产量，还会增加细胞的代谢负担，阻碍代谢流向目标产物的合成
。
实现对细胞内源性启动子的连续精确调控是一个难点
。
诱导型启动子通过在一定范围内添加不同浓度的诱导剂，具有易于控制其表达量的优点，但是在大规模的工业生产中，使用
IPTG
作为诱导剂因其成本和毒性而不可行，而且一旦超过或低于一定的诱导范围，只能实现单一的“是”或“否”表达模式
。
组成型启动子，一旦其序列已经确定，具有固定水平的基因表达效率，无法人为控制
。
这些项目的难点在于通常很难确定合适的表达水平，即使表达水平已知，仍有很多未知因素
。
[0006]因此，需要一种新的方法来进行更有效的通量优化，以促进工业化产品的合成和最大限度地提高底物利用率
。
(三)
技术实现思路

[0007]本专利技术提供一种非诱导型
β
‑
丙氨酸基因工程菌及其构建与应用，以一株高产
β
‑
丙氨酸的大肠杆菌代谢工程菌
630A
为出发菌株，敲除基因
lacI
，筛选合适来源的
β
‑
丙氨酸合成途径中的关键基因提高基因表达的稳定性和活性，利用大肠杆菌中内源性启动子和
5'UTR
序列进行多重配对组装形成新的非诱导型表达元件
PUTR
，对大肠杆菌
β
‑
丙氨酸合成途径中的关键基因进行表达调控，筛选出适应
β
‑
丙氨酸生产菌株的
PUTR
序列提高
β
‑
丙氨酸合成途径中的关键基因的转录水平；再通过增强
β
‑
丙氨酸合成的中心碳流，利用自调控启动子
P
flic
动态弱化
β
‑
丙氨酸的竞争途径等代谢工程手段，获得一株适合工业化生产的
β
‑
丙氨酸生产菌株，对扩大大肠杆菌的工业应用具有重要意义
。
[0008]本专利技术采用的技术方案：
[0009]本专利技术提供一种非诱导型
β
‑
丙氨酸基因工程菌，所述基因工程菌按如下步骤构建：
(1)
通过敲除出发菌株的
lacI
基因实现非诱导型底盘菌的构建；
(2)
通过大肠杆菌内源性启动子和
5'UTR
序列构成的非诱导型表达元件
PUTR
分别表达步骤
(1)
菌株的
panD
基因和
aspB
基因，提高转录水平；
(3)
通过
CRISPR
‑
Cas9
技术分别将步骤
(2)
菌株基因组假基因位点
ycgH、yeeP、yeeL
中的一种或多种替换成用
trc
启动子表达的
panD、aspB
或
ppc
中的一种或多种；
(4)
通过大肠杆菌
fliC
启动子对步骤
(3)
菌株的
thrA
基因进行动态调控；所述出发菌株为
E.coliW3110/TrcpanD
BS
::panD/Trcppc/Trcglk/TrcgltBD/
Δ
glaR/
Δ
cycA/
Δ
iclR/
Δ
ptsG/lysC*
，记为菌株
630A0；
[0010]所述表达
panD<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种非诱导型
β
‑
丙氨酸基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌按如下步骤构建：
(1)
敲除出发菌株的
lacI
基因；所述出发菌株为
E.coliW3110/TrcpanD
BS
::panD/Trcppc/Trcglk/TrcgltBD/
Δ
glaR/
Δ
cycA/
Δ
iclR/
Δ
ptsG/lysC*
；
(2)
通过非诱导型表达元件
PUTR
分别表达步骤
(1)
菌株的
panD
基因和
aspB
基因；所述表达
panD
基因的非诱导型表达元件
PUTR
的核苷酸序列如
SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18
中的一种所示；表达
aspB
基因的非诱导型表达元件
PUTR
的核苷酸序列如
SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21
中的一种所示；
(3)
将步骤
(2)
菌株假基因位点
ycgH、yeeP、yeeL
中的一种或多种替换成用
trc
启动子表达的
panD、aspB
或
ppc
中的一种或多种；
(4)
通过大肠杆菌
fliC
启动子对步骤
(3)
菌株的
thrA
基因进行动态调控，获得非诱导型
β
‑
丙氨酸基因工程菌
。2.
如权利要求1所述非诱导型
β
‑
丙氨酸基因工程菌，其特征在于，步骤
(2)
表达
panD
基因的非诱导型表达元件
PUTR
的核苷酸序列如
SEQ ID NO.18
所示；表达
aspB
基因的非诱导型表达元件
PUTR
的核苷酸序列如
SEQ ID NO.21
所示
。3.
如权利要求1所述非诱导型
β
‑
丙氨酸基因工程菌，其特征在于，所述
trc
启动子核苷酸序列如
SEQ ID NO.12
所示；所述
fliC
启动子序列如
SEQ ID NO.13
所示
。4.
如权利要求1所述非诱导型
β
‑
丙氨酸基因工程菌，其特征在于，所述
lacI
基因核苷酸序列如
SEQ ID NO.1
所示，
panD
基因核苷酸序列如
SEQ ID NO.5
所示，
aspB
基因核苷酸序列如
SEQ ID NO.9
所示，
ppc
基因核苷酸序列如
SEQ ID NO.10
所示，
thrA
基因核苷酸序列如
SEQ ID NO.11
所示
。5.
如权利要求1所述非诱导型
β
‑
丙氨酸基因工程菌，其特征在于，步骤
(2)
通过非诱导型表达元件
PUTR
分别表达...

【专利技术属性】
技术研发人员：柳志强，丁文清，周海岩，张昔，顾雨航，胡忠策，郑裕国，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：