一步法生产麦角硫因的谷氨酸棒杆菌的菌株构建和应用制造技术

本发明专利技术公开了一步法生产麦角硫因的谷氨酸棒杆菌的菌株构建和应用，属于合成生物学

【技术实现步骤摘要】
一步法生产麦角硫因的谷氨酸棒杆菌的菌株构建和应用


[0001]本专利技术涉及一步法生产麦角硫因的谷氨酸棒杆菌的菌株构建和应用，属于合成生物学
、
酶工程
、
代谢工程

。

技术介绍

[0002]麦角硫因
(Ergothioneine
，
EGT)
，又称麦角含硫碱，是一种来源于植物，并且可以在动物中积累的天然氨基酸，在人体内可以对细胞起到保护作用，是机体内的重要活性物质
。
麦角硫因作为一种天然抗氧化剂，安全，无毒，已经成为研究的热点，它具有清除自由基，解毒，维持
DNA
的生物合成，细胞的正常生长及细胞免疫等多种生理功能，在化妆品
、
保健品及医药等行业极具应用前景
。
[0003]麦角硫因的制备方法包括天然生物提取法
、
化学合成法和微生物合成法
。
其中天然生物提取法是从食用菌的子实体
、
动物组织
、
猪血
、
谷物和麦角中提取麦角硫因；化学法合成主要是将巯基导入咪唑环；微生物合成法是以蕈菌菌丝体深层发酵技术生物合成制备麦角硫因，通过代谢调控等发酵过程控制手段提高麦角硫因的产率
。
近年来已经有一些专利报道了关于使用微生物来生产麦角硫因，通过基因工程手段改造宿主如大肠杆菌
、
酿酒酵母
、
枯草芽孢杆菌等，表达外源麦角硫因合成酶生产麦角硫因，是目前研究的热点
。
[0004]传统的麦角硫因生产主要是通过化学合成或生物提取，目前化学方法合成麦角硫因困难，且存在产品安全性难以保证
、
合成原料及成本高昂等缺点；从富含麦角硫因的食用菌中提取存在提取效率低
、
耗费时间长
、
难以大规模制备等问题，不能从根源上解决麦角硫因产量不足，使得大规模生产难以满足不断增长的市场需求
。
在常用工业底盘菌株内，与大肠杆菌等相比，谷氨酸棒杆菌具有合成麦角硫因前体：组氨酸
、
半胱氨酸等氨基酸的能力，是大规模生产麦角硫因的潜力菌株
。

技术实现思路

[0005]本专利技术提供一种谷氨酸棒杆菌底盘细胞，在谷氨酸棒杆菌出发菌株的基础上，包含了如下改进：
[0006](1)
降低磷酸烯醇丙酮酸羧化激酶
、L
‑
丝氨酸脱氨酶
、
转录激活因子
glyR、
磷酸乙酰转移酶
、
丙酮酸脱氢酶
、
乳酸脱氢酶中至少一种酶的表达；
[0007](2)
增强丝氨酸
O
‑
乙酰转移酶
、
磷酸甘油酸脱氢酶
、
磷酸丝氨酸转氨酶
、6
‑
磷酸果糖激酶
、
磷酸甘油酸激酶
PGK、
磷酸核糖
‑
ATP
环水解酶
、O
‑
乙酰丝氨酸裂解酶中至少一个酶的表达
。
[0008]在一种实施方式中，所述磷酸烯醇丙酮酸羧化激酶具有
Genbank
登录号
CAF20888.1
所示的氨基酸序列，或与所述氨基酸序列具有至少
90
％，
91
％，
92
％，
93
％，
94
％，
95
％，
96
％，
97
％，
98
％，
99
％，
99.1
％，
99.2
％，
99.3
％，
99.4
％，
99.5
％，
99.6
％，
99.7
％，
99.8
％，
99.9
％同源性的氨基酸序列
。
[0009]在一种实施方式中，所述
L
‑
丝氨酸脱氨酶具有
Genbank
登录号：
CAF20029.1
所示的
氨基酸序列，或与所述氨基酸序列具有至少
90
％，
91
％，
92
％，
93
％，
94
％，
95
％，
96
％，
97
％，
98
％，
99
％，
99.1
％，
99.2
％，
99.3
％，
99.4
％，
99.5
％，
99.6
％，
99.7
％，
99.8
％，
99.9
％同源性的氨基酸序列
。
[0010]在一种实施方式中，所述转录激活因子
glyR
具有
Genbank
登录号：
ASW13231.1
所示的氨基酸序列，或与所述氨基酸序列具有至少
90
％，
91
％，
92
％，
93
％，
94
％，
95
％，
96
％，
97
％，
98
％，
99
％，
99.1
％，
99.2
％，
99.3
％，
99.4
％，
99.5
％，
99.6
％，
99.7
％，
99.8
％，
99.9
％同源性的氨基酸序列
。
[0011]在一种实施方式中，所述磷酸乙酰转移酶具有
Genbank
登录号：
CAF20775.1
所示的氨基酸序列，或与所述氨基酸序列具有至少
90
％，
91
％，
92
％，
93
％，
94
％，
95
％，
96
％，
97
％，
98
％，
99
％，
99.1
％，
99.2
％，
99.3
％，
99.4
％，
99.5
％，
99.6
％，
99.7
％，
99.8
％，
99.9
％同源性的氨基酸序列
。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种谷氨酸棒杆菌底盘细胞，其特征在于，在谷氨酸棒杆菌出发菌株的基础上，包含了如下改进：
(1)
降低磷酸烯醇丙酮酸羧化激酶
、L
‑
丝氨酸脱氨酶
、
转录激活因子
glyR、
磷酸乙酰转移酶
、
丙酮酸脱氢酶
、
乳酸脱氢酶中至少一种酶的表达；
(2)
增强丝氨酸
O
‑
乙酰转移酶
、
磷酸甘油酸脱氢酶
、
磷酸丝氨酸转氨酶
、6
‑
磷酸果糖激酶
、
磷酸甘油酸激酶
、
磷酸核糖
‑
ATP
环水解酶
、O
‑
乙酰丝氨酸裂解酶中至少一个酶的表达
。2.
根据权利要求1所述的谷氨酸棒杆菌底盘细胞，其特征在于，在谷氨酸棒杆菌出发菌株的基础上，包含了如下至少一种改进：
(1)
敲除磷酸烯醇丙酮酸羧化激酶基因
pck
，增强丝氨酸
O
‑
乙酰转移酶
cysE
的表达：
(2)
敲除
L
‑
丝氨酸脱氨酶基因
sdaA
，增强磷酸甘油酸脱氢酶的表达；
(3)
敲除转录激活因子
glyR
，增强磷酸丝氨酸转氨酶的表达；
(4)
敲除磷酸乙酰转移酶基因
PTA
，增强6‑
磷酸果糖激酶的表达；
(5)
用启动子
Ptuf
替换磷酸丝氨酸磷酸酶
serB
的启动子区，增强磷酸甘油酸激酶的表达，
(6)
用启动子
P
tuf
替换亚硫酸还原酶
cysI
的启动子区，增...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱凌峰，彭莺祺，杨洋，曹利红，罗小舟，刘忠，
申请(专利权)人：中国科学院深圳先进技术研究院，
类型：发明
国别省市：