一种组成型启动子改造的高产脂肽工程菌株及其构建方法技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，尤其是涉及一种组成型启动子改造的高产脂肽工程菌株及其构建方法

【技术实现步骤摘要】
一种组成型启动子改造的高产脂肽工程菌株及其构建方法


[0001]本专利技术涉及生物
，尤其是涉及一种组成型启动子改造的高产脂肽工程菌株及其构建方法
。

技术介绍

[0002]随着环境保护观念的广泛普及和认可，绿色化学品和环保工艺的重要性日益凸显
。
在这个背景下，研究人员旨在开发更具可持续性和环保性的化学品和工业过程，以满足人们对绿色化学品的需求以及可持续发展的战略目标
。
其中，生物表面活性剂具备低毒性
、
环保性和可生物降解等特性，成为研究和工业领域关注的焦点
。
[0003]Surfactin
是一种由枯草芽孢杆菌产生的脂肽类生物表面活性剂，它是由七个氨基酸组成的环肽和含
12
‑
17
个碳原子的的
β
‑
羟基脂肪酸链构成
。Surfactin
具有独特的化学结构和生物活性，使其在许多应用领域具有重要的价值
。
[0004]在工业生产中，野生菌产生的
surfactin
产量普遍较低，是限制
surfactin
工业化应用的主要因素之一
。
目前，
surfactin
的增产方法主要是通过优化培养条件以及对菌株进行基因改造
。
在优化培养条件方面，专利
CN 110669811
公开了将解淀粉芽孢杆菌
HM
‑
618
种子液按
OD
600
为
0.1
～
0.3
接入发酵培养基中，施加一定培养条件可提高
surfactin
产量；随后专利
CN 110699408
公开了将解淀粉芽孢杆菌
HM
‑
618
和枯草芽孢杆菌共培养，进一步提高
surfactin
产量；
CN 106635869
公开了应用筛选的解淀粉芽孢杆菌
MT45
，优化培养条件，发酵
55h
最高生产
9.43g/L
的
surfactin
；
CN 114214252
公开了在发酵培养基中添加脂肪醇及其衍生物并调节
pH
为弱酸性，提高
surfactin
的产量
。
另外一些研究者通过基因工程的方法对芽孢杆菌进行改造，
CN 102242142、CN 102174558、CN 102220367
和
CN 102220366
分别公开了在枯草芽孢杆菌
ATCC9943
中过表达
phrC
基因
、
过表达
comA
基因
、
敲除
abrB
基因及过表达
yerP
基因构建了枯草芽孢杆菌
FMB25、27、29
和
45
，
surfactin
产量从
777mg/L
分别提高到了
1596、1605、1091
和
1266mg/L
；
CN 103898038
公开了在枯草芽孢杆菌
THY
‑7中过表达
ycxA
基因，
surfactin
产量提高了
97
％；
CN 110331121、CN 109097315
和
CN 109554321
公开了在
THY
‑
7/P
g3
‑
srfA
中过表达
LeuABCD
‑
ilvK、
过表达
yngH
基因
、
敲除
spoIVB
基因，
surfactin
产量分别提高了
55.6
％
、47
％
、25
％
。
基因改造过程中的启动子改造效果较为明显，
CN 101402959
中公开了使用
IPTG
诱导型启动子
P
spaC
替换枯草芽孢杆菌
fmbR
中的
P
srfA
启动子，在添加诱导剂时
surfactin
产量提高
10
倍；
CN 105400784
公开了一种强启动子
P
g3
，替换枯草芽孢杆菌
THY
‑7原始启动子，加入诱导型后
surfactin
产量提高了
17.7
倍
。
[0005]然而，上述启动子工程的改造的方法均需使用诱导型启动子，化学诱导剂的引入不仅增加了成本，并且会影响
surfactin
在食品
、
化妆品等领域的应用
。

技术实现思路

[0006]为了解决克服野生菌的
surfactin
产量较低，且诱导型启动子替换需要引入诱导剂的问题，本专利技术的目的是提供一种组成型启动子改造的高产脂肽工程菌株及其构建方
法
。
本专利技术运用分子生物学的方法将原始菌株的
P
srfA
启动子部分序列替换为
P
hemA
启动子，本专利技术构建的工程菌株强化
surfactin
合成途径，显著提高了枯草芽孢杆菌的
surfactin
产量，并且相比于诱导型启动子，组成型启动子做表达时无需添加诱导剂，可用于脂肽类生物表面活性剂的生产，具有潜在的工业应用价值
。
[0007]本专利技术的目的可以通过以下技术方案来实现：
[0008]本专利技术的第一个目的是提供一种组成型启动子改造的高产脂肽工程菌株，所述工程菌株由组成型启动子
P
hemA
替换原始菌株的
P
srfA
启动子得到；
[0009]其中，所述组成型启动子
P
hemA
的核苷酸序列如
SEQ ID NO.1
所示；
P
srfA
启动子部分序列的核苷酸序列如
SEQ ID NO.18
所示；
[0010]所述原始菌株选自枯草芽孢杆菌
、
解淀粉芽孢杆菌或贝莱斯芽孢杆菌中的一种
。
[0011]在本专利技术的一个实施方式中，所述原始菌株为枯草芽孢杆菌
TD7(Bacillus subtilis TD7)。
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种组成型启动子改造的高产脂肽工程菌株，其特征在于，所述工程菌株由组成型启动子
P
hemA
替换原始菌株的
P
srfA
启动子部分序列得到；其中，所述组成型启动子
P
hemA
的核苷酸序列如
SEQ ID NO.1
所示；
P
srfA
启动子部分序列的核苷酸序列如
SEQ ID NO.18
所示；所述原始菌株选自枯草芽孢杆菌
、
解淀粉芽孢杆菌或贝莱斯芽孢杆菌中的一种
。2.
根据权利要求1所述的一种组成型启动子改造的高产脂肽工程菌株，其特征在于，所述原始菌株为
Bacillus subtilis TD7。3.
一种如权利要求1～2任一所述的组成型启动子改造的高产脂肽工程菌株的构建方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
(A1)
将质粒
pJ
‑
P
hemA
转化入原始菌株的感受态细胞中，得到重组菌株；
(A2)
将步骤
(A1)
制备得到的重组菌株预处理后进行
CRISPR/Cas9
基因编辑，将原始菌株的
P
srfA
启动子替换为组成型启动子
P
hemA
，得到组成型启动子改造的高产脂肽工程菌株
。4.
根据权利要求3所述的一种组成型启动子改造的高产脂肽工程菌株的构建方法，其特征在于，步骤
(A1)
中，质粒
pJ
‑
P
hemA
为质粒
pJOE8999
接入
N
srfA
、
上游同源臂
、P
hemA
启动子
、
下游同源臂得到的改造质粒
。5.
根据权利要求4所述的一种组成型启动子改造的高产脂肽工程菌株的构建方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：牟伯中，周蕾，刘一凡，杨世忠，魏昊勋，
申请(专利权)人：华东理工大学，
类型：发明
国别省市：