一株共表达多元纤维素酶基因的枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用技术

本发明专利技术涉及微生物基因工程技术领域，尤其涉及一株共表达多元纤维素酶基因的枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用

【技术实现步骤摘要】
一株共表达多元纤维素酶基因的枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用


[0001]本专利技术涉及微生物基因工程
，尤其涉及一株共表达多元纤维素酶基因的枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用
。

技术介绍

[0002]农作物秸秆，是大自然中最宝贵
、
最便宜的可再生资源之一，是潜在的动物饲料来源，同时也是规模最大的一类农业废弃物，全世界每年可产生超过五十亿吨的农作物残茬
。
农作物秸秆的主要成分木质素
、
纤维素
、
半纤维素等，均属于芳香族高分子化合物，具有难以在自然环境中被降解的复杂三维结构，阻碍纤维素和半纤维素被进一步利用，因而常对秸秆进行预处理以提高纤维素的利用率
。
预处理方法可分为物理法
、
化学法和生物法
。
相对于前两种方法，生物降解更能节省人力
、
物力和财力，是一种较为理想的降解纤维素的方法
。
纤维素酶可分为三类：内切葡聚糖酶
(Endoglucanase,EG,EC:3.2.1.4)、
外切葡聚糖酶
(Exoglucanase,CBH,EC:3.2.1.91)
和
β
‑
葡萄糖苷酶
(
β
‑
glucosidase,BG,EC:3.2.1.21)
，它们协同作用于纤维素使其彻底降解为葡萄糖
。
[0003]枯草芽孢杆菌作为一种被深入研究的模式菌，其代谢机理和遗传背景相对清晰，具有异源蛋白分泌能力强
、
低品质碳源上生长特性好
、
无明显密码子偏好性等特点，属于我国的饲用益生菌准用菌种，现已应用于构建酶
、
维生素
、
功能性糖等天然产物合成的微生物细胞工厂
。
虽然枯草芽孢杆菌本身具备良好的纤维素酶分泌能力，但因其纤维素酶系不完整，单菌直接作用于粗饲料的降解效果不佳，尤其体现在外切葡聚糖酶和木质素酶的缺乏方面，不能高效破坏植物细胞壁的纤维结晶结构
。
因此，通过对枯草芽孢杆菌的遗传改造或异源酶基因的高效表达，获得具有益生菌特性且能高效降解纤维素的枯草芽孢杆菌基因工程重组菌能够更加满足畜禽养殖业中饲用微生物添加的生产需求
。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供一株共表达多元纤维素酶基因的枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用
。
[0005]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0006]本专利技术提供了一株共表达多元纤维素酶基因的枯草芽孢杆菌
C6
‑
AEA3
，所述枯草芽孢杆菌
C6
‑
AEA3
分类为
Bacillussubtilis
，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国武汉武汉大学，保藏日期为
2023
年8月
31
日，保藏编号为
CCTCCNO:M 20231579。
[0007]本专利技术还提供了所述的枯草芽孢杆菌
C6
‑
AEA3
的构建方法，包括如下步骤：
[0008]以野生型枯草芽孢杆菌为出发菌株，依次在所述出发菌株中敲入内切葡聚糖酶基因
、
外切葡聚糖酶基因和
β
‑
葡聚糖酶基因；
[0009]所述野生型枯草芽孢杆菌为
Bacillus subtilis C6
，野生型枯草芽孢杆菌
Bacillus subtilis C6
，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国武汉武汉大学，保藏
日期为
2022
年9月
26
日，保藏编号为
CCTCCNO:M 20221488。
[0010]作为优选，所述敲入的方法基于
CRISPR/Cas9
系统
。
[0011]作为优选，所述内切葡聚糖酶基因为内切葡聚糖酶基因
gene2006
；所述内切葡聚糖酶基因
gene2006
的核苷酸序列如
SEQ ID NO.1
所示；
[0012]敲入所述内切葡聚糖酶基因的位点为野生型枯草芽孢杆菌的
aprE
位点
。
[0013]作为优选，所述外切葡聚糖酶基因为外切葡聚糖酶基因
Cel48S
；所述外切葡聚糖酶基因
Cel48S
的核苷酸序列如
SEQ ID NO.2
所示；
[0014]敲入所述外切葡聚糖酶基因的位点为野生型枯草芽孢杆菌的
epr
位点
。
[0015]作为优选，所述
β
‑
葡聚糖酶基因为
β
‑
葡聚糖酶基因
gene4296
；所述
β
‑
葡聚糖酶基因
gene4296
的核苷酸序列如
SEQ ID NO.3
所示；
[0016]敲入所述
β
‑
葡聚糖酶基因的位点为野生型枯草芽孢杆菌的
amyE
位点
。
[0017]本专利技术还提供了所述的枯草芽孢杆菌
C6
‑
AEA3
或者所述的构建方法构建得到的枯草芽孢杆菌
C6
‑
AEA3
在制备降解纤维素的产品中的应用
。
[0018]本专利技术还提供了所述的枯草芽孢杆菌
C6
‑
AEA3
或者所述的构建方法构建得到的枯草芽孢杆菌
C6
‑
AEA3
在制备降解秸秆中纤维素的产品中的应用；
[0019]所述秸秆为玉米秸秆
、
小麦秸秆和水稻秸秆中的一种或几种
。
[0020]本专利技术还提供了一种降解秸秆中纤维素的方法，包括如下步骤：
[0021]将秸秆
、
浸润培养基与发酵菌液混合，发酵6～
8d
；
[0022]所述发酵菌液为所述的枯草芽孢杆菌
C6
‑
AEA3
或者所述的构建方法构建得到的枯草芽孢杆菌
C6
‑
AEA3
制备得到的发酵菌液；
[0023]所述发酵菌液的制备方法为：将枯草芽孢杆菌
C6
‑
AEA3
接种于
LB
培养基中，培养
15
～
17h
，得到活化的菌液；将所述活化的菌液接种于
LB
培养基中，培养
20
～
28h...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一株共表达多元纤维素酶基因的枯草芽孢杆菌
C6
‑
AEA3
，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌
C6
‑
AEA3
分类为
Bacillussubtilis
，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国武汉武汉大学，保藏日期为
2023
年8月
31
日，保藏编号为
CCTCC NO:M 20231579。2.
权利要求1所述的枯草芽孢杆菌
C6
‑
AEA3
的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：以野生型枯草芽孢杆菌为出发菌株，依次在所述出发菌株中敲入内切葡聚糖酶基因
、
外切葡聚糖酶基因和
β
‑
葡聚糖酶基因；所述野生型枯草芽孢杆菌为
Bacillus subtilis C6
，野生型枯草芽孢杆菌
Bacillus subtilis C6
，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国武汉武汉大学，保藏日期为
2022
年9月
26
日，保藏编号为
CCTCCNO:M 20221488。3.
根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述敲入的方法基于
CRISPR/Cas9
系统
。4.
根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述内切葡聚糖酶基因为内切葡聚糖酶基因
gene2006
；所述内切葡聚糖酶基因
gene2006
的核苷酸序列如
SEQ ID NO.1
所示；敲入所述内切葡聚糖酶基因的位点为野生型枯草芽孢杆菌的
aprE
位点
。5.
根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述外切葡聚糖酶基因为外切葡聚糖酶基因
Cel48S
；所述外切葡聚糖酶基因
Cel48S
的核苷酸序列如
SEQ ID NO.2
所示；敲入所述外切葡聚糖酶基因的位点为野生型枯草芽孢杆菌的
epr
位点
。6.
根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述
β
‑
葡聚糖酶基因为
β
‑
葡聚糖酶基因
gene4296
；所述
β
‑
葡聚糖酶基因
gene4296
的核苷酸序列如

【专利技术属性】
技术研发人员：杨雨鑫，陈玉林，刘功炜，公涵萱，崔雯元，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：