一种高产制造技术

一种高产

【技术实现步骤摘要】
一种高产D
‑
甘露糖的嗜甲烷工程菌及其构建方法


[0001]本专利技术属于工业生物
，特别涉及一种高产
D
‑
甘露糖的嗜甲烷工程菌及其构建方法
。

技术介绍

[0002]D
‑
甘露糖是一种天然的低热量生物活性单糖，已广泛应用于食品
、
医药
、
饲料等领域
。D
‑
甘露糖具有益生元作用，促进抗炎和抗炎细胞因子的表达，也可用作生产维生素
、
抗肿瘤剂和免疫刺激剂的起始原料
。
另外，
D
‑
甘露糖是银耳多糖的前体物质，银耳多糖不但具有优异的提高人体免疫机能
、
抗病毒
、
降血糖等生理作用，而且具有超强的保水性和很好的成膜性，作为天然保湿剂应用在化妆品领域受到广泛的重视
。
目前，甘露糖及其衍生物在保健食品
、
功能食品
、
化妆品
、
生物医药等行业受到广泛关注，其需求量不断扩大
。
[0003]目前，
D
‑
甘露糖的制备方法主要包括：提取法
、
化学转化法和微生物酶转化法
。
提取法主要从水果和植物等原料中的甘露糖直接提取；化学转化法则是以钼酸盐作为催化剂，在酸性高温高压下将葡萄糖异构化为
D
‑
甘露糖；酶转化法是通过异构酶直接将葡萄糖或果糖转化为
D
‑
甘露糖
。
由于能耗高
、
反应条件苛刻
、
易形成副产物
、
下游纯化困难等问题，提取法和化学转化法的应用均具有局限性，不能满足工业要求
。
与提取法和化学转化法不同，微生物酶转化法具有反应条件温和
、
反应过程可控
、
副反应少
、
环境友好等许多优点
。
[0004]由于微生物具有生长速度快
、
周期短
、
生长条件温和
、
代谢过程简单和分布广泛等优点，所以微生物发酵法生产
D
‑
甘露糖不受空间
、
环境和资源的限制，具有成本低
、
无化学残留和产量高等显著优点，是生产医药及食品级
D
‑
甘露糖的一条理想途径
。
但是微生物发酵法制备
D
‑
甘露糖的产量还远不能满足生产需求，产量及生产效率亟待提高
。
吴昊等人发表
《WU Hao,HUANG Jia
‑
Wei,etc.One
‑
pot production of D
‑
mannose from D
‑
glucose by recombinant co
‑
expressing Escherichia coli cells[J].Microbiology China,2020,47(7):2151
‑
2160.》
，其通过重组大肠杆菌生产
D
‑
甘露糖，但是在最佳反应条件下，也仅可转化
100g/L
的
D
‑
葡萄糖产生
13.8g/L
的
D
‑
甘露糖
。

技术实现思路

[0005]为解决上述现有技术存在的问题，本专利技术提供一种高产
D
‑
甘露糖的嗜甲烷工程菌及其构建方法，通过代谢工程改造实现了
D
‑
甘露糖异构酶
MI
这一异源基因的体内表达和己糖激酶
HK
与磷酸葡萄糖异构酶
PGI
内源基因的过表达，有效提高了利用甲烷或甲醇合成
D
‑
甘露糖的得率和效率，并将其应用在
D
‑
甘露糖的生产中，实现嗜甲烷菌合成
D
‑
甘露糖的过程强化和高产
。
[0006]为了达到上述目的，本专利技术采用的技术方案为：
[0007]一种高产
D
‑
甘露糖的嗜甲烷工程菌，包括在宿主菌中导入的外源
D
‑
甘露糖异构酶
MI
，以及在宿主菌中过表达的内源己糖激酶
HK
和磷酸葡萄糖异构酶
PGI。
[0008]所述宿主菌为产糖原嗜甲烷菌
(Alkalicoccus glycogenes)WONF2802
宿主菌，该
菌已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏菌号
CGMCC NO.XYZ。
[0009]所述
D
‑
甘露糖异构酶
MI
来源于恶臭假单胞菌
Pseudomonas putida SK27.016
，其核苷酸序列如序列表
SEQ ID NO.1
所示
。
[0010]所述己糖激酶
HK
和磷酸葡萄糖异构酶
PGI
均来源于嗜甲烷菌
WONF2802
；基因
hk
的核苷酸序列如序列表
SEQ ID NO.2
所示；所述基因
pgi
的核苷酸序列如序列表
SEQ ID NO.3
所示
。
[0011]所述的高产
D
‑
甘露糖的嗜甲烷基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
[0012](1)
将基因
hk
和
pgi
按照
P
tac
‑
hk
‑
pgi
的顺序串联得到
P
tac
‑
hp
片段，利用基因编辑手段，将嗜甲烷菌
WONF2802
上的
glgA1
基因用
P
tac
‑
hp
替换，得到嗜甲烷工程菌菌株
GAN1
；
[0013](2)
将外源基因
mi
与质粒
pAWP89
相连构建重组质粒
pAWP89
‑
mi
，然后转入菌株
GAN1
中，得到产物嗜甲烷工程菌菌株
GAN2。
[0014]相对于现有技术，本专利技术有益效果体现在：
[0015]1.
本专利技术提供了一种高产
D
‑
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种高产
D
‑
甘露糖的嗜甲烷工程菌，其特征在于，包括在宿主菌中导入的外源
D
‑
甘露糖异构酶
MI
，以及在宿主菌中过表达的内源己糖激酶
HK
和磷酸葡萄糖异构酶
PGI。2.
根据权利要求书1所述的一种高产
D
‑
甘露糖的嗜甲烷工程菌，其特征在于，所述宿主菌为产糖原嗜甲烷菌
(Alkalicoccusglycogenes)WONF2802
宿主菌，该菌已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏菌号
CGMCC NO.XYZ。3.
根据权利要求书1所述的一种高产
D
‑
甘露糖的嗜甲烷工程菌，其特征在于，所述
D
‑
甘露糖异构酶
MI
来源于恶臭假单胞菌
Pseudomonasputida SK27.016
，其核苷酸序列如序列表
SEQ ID NO.1
所示
。4.
根据权利要求书1所述的一种高产
D
‑
甘露糖的嗜甲烷工程菌，其特征在于，所述己糖激酶
HK
和磷酸葡萄糖异构酶
PGI
均来源于嗜甲烷菌
WONF...

【专利技术属性】
技术研发人员：费强，吴晶，范代娣，傅容湛，
申请(专利权)人：西安巨子生物基因技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：