一种用于替代高致病性志贺菌的大肠埃希菌菌株的制备方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种用于替代高致病性志贺菌的大肠埃希菌菌株的制备方法及其应用，该方法采用

【技术实现步骤摘要】
一种用于替代高致病性志贺菌的大肠埃希菌菌株的制备方法及其应用


[0001]本专利技术涉及医学微生物学领域，具体涉及一种用于替代高致病性志贺菌的大肠埃希菌菌株的制备方法，还涉及所述方法制备得到的大肠埃希菌菌株在医学微生物学实验室课程中作为志贺氏菌替代品中的应用
。

技术介绍

[0002]在医学微生物学实验室中，学生需要掌握肠杆菌科常见细菌的鉴别方法
。
主要内容为通过微生物培养
、
菌落观察
、
血清学实验和生化反应实验区分常见的肠杆菌科细菌：大肠埃希菌
、
志贺菌和沙门菌
。
然而，除大肠埃希菌外，沙门菌和志贺菌都属于由中华人民共和国卫生部制定的
《
人间传染的病原微生物名录
》
菌种，对其进行培养需要至少在生物安全等级
II
级及以上的实验室中进行操作
。
这大大提高了实验室要求和成本，限制了实验课程在条件不足的高校的开展
。
[0003]此外，在医院检验科的临床微生物学检验中，质谱仪不能区分志贺菌和大肠埃希菌，因此，二者主要依赖于生化反应实验和血清学实验，为了确保实验用品的质量，从而保证检出效果，需要对实验药品进行质控
。
然而，使用志贺菌作为质控样品，增加了实验室安全等级
、
运输要求和生物安全风险
。
[0004]而大肠埃希菌是人体正常菌群中常见菌种，普通的大肠埃希菌菌株致病性低，未列入
《
人间传染的病原微生物名录
》
，而大肠埃希菌菌株
E.coli DH5
α
常作为工具微生物，常进行各种生物和医学实验研究
。
如果能通过基因编辑和改造，使大肠埃希菌具有志贺菌的生物学鉴别特征，但保留大肠埃希菌的低生物安全危害，从而模拟志贺菌用于医学微生物实验教学和临床检验质控，则有助于降低生物安全风险和使用成本
。

技术实现思路

[0005]有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种用于替代高致病性志贺菌的大肠埃希菌菌株的制备方法；本专利技术的目的之二在于提供所述方法制备得到的大肠埃希菌菌株在医学微生物学实验室课程中作为志贺氏菌替代品中的应用
。
[0006]为达到上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
[0007]1、
一种用于替代高致病性志贺菌的大肠埃希菌菌株的制备方法，包含如下步骤：
[0008]a)
敲除
E.coli DH5a
的
tnaA
基因
[0009]首先以
E.coliDH5a
基因组为模板，采用
PCR
技术扩增
tnaA
基因，获得
tnaA
‑
donor
片段；合成
tnaA
基因靶点引物，然后利用一步退火法构建含有
tnaA
基因靶点的质粒
pTarget
‑
tnaA
，经
DpnI
酶切后转化到
E.coli DH5
α
细胞中并提取质粒；最后将
pTarget
‑
tnaA
和
tnaA
‑
donor
供体片段混合后，电转化
L
‑
阿拉伯糖诱导的含
pCas
的
DH5
α
感受态细菌，于包含
Kan
和
Spe
的
LB
平板上
30℃
培养，筛选获得
tnaA
基因敲除菌株
E.coli DH5
αΔ
tnaA
；
[0010]b)
敲除
E.coliDH5
αΔ
tnaA
的
FliC
基因
[0011]首先以
E.coliDH5a
基因组为模板，采用
PCR
技术扩增
FliC
基因，获得
FliC
‑
donor
片段；合成
FliC
基因靶点引物，然后利用一步退火法构建含有
FliC
基因靶点的质粒
pTarget
‑
FliC
，经
DpnI
酶切后转化到
E.coli DH5
α
细胞中并提取质粒；最后将
pTarget
‑
FliC
和
FliC
‑
donor
供体片段混合后，电转化
L
‑
阿拉伯糖诱导的含
pCas
的
E.coli DH5
αΔ
tnaA
感受态细菌，于包含
Kan
和
Spe
的
LB
平板上
30℃
培养，筛选获得
tnaA
基因和
FliC
基因双敲除的大肠杆菌
E.coli DH5
αΔ
tnaA
Δ
FliC
；
[0012]c)
向
E.coli DH5
αΔ
tnaA
Δ
FliC
转入福氏志贺菌菌体抗原
2a
基因簇
[0013]将
S.flexneri 2a O
抗原表达质粒转化到
E.coli DH5
αΔ
tnaA
Δ
FliC
菌株中，获得具有志贺菌的血清学特征大肠杆菌
E.coliDH5
αΔ
FliC
Δ
tnaA 2a。
[0014]本专利技术优选的，步骤
a
中，所述
tnaA
‑
donor
片段的序列为
SEQ ID No.5
所示
。
[0015]本专利技术优选的，步骤
a
中，所述
tnaA
基因靶点引物的序列为
SEQ ID No.6
～7所示
。
[0016]本专利技术优选的，步骤
b
中，所述
FliC
‑
donor
片段的序列为
SEQ ID No.12
所示
。
[0017]本专利技术优选的，步骤
b
中，所述
FliC
基因靶点引物的序列为
SEQ ID No.13
～
14
所示
。
[0018]本专利技术优选的，步骤
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种用于替代高致病性志贺菌的大肠埃希菌菌株的制备方法，其特征在于，包含如下步骤：
a)
敲除
E.coli DH5a
的
tnaA
基因首先以
E.coliDH5a
基因组为模板，采用
PCR
技术扩增
tnaA
基因，获得
tnaA
‑
donor
片段；合成
tnaA
基因靶点引物，然后利用一步退火法构建含有
tnaA
基因靶点的质粒
pTarget
‑
tnaA
，经
DpnI
酶切后转化到
E.coli DH5
α
细胞中并提取质粒；最后将
pTarget
‑
tnaA
和
tnaA
‑
donor
供体片段混合后，电转化
L
‑
阿拉伯糖诱导的含
pCas
质粒的
DH5
α
感受态细菌，于包含
Kan
和
Spe
的
LB
平板上
30℃
培养，筛选获得
tnaA
基因敲除菌株
E.coli DH5
αΔ
tnaA
；
b)
敲除
E.coliDH5
αΔ
tnaA
的
FliC
基因首先以
E.coliDH5a
基因组为模板，采用
PCR
技术扩增
FliC
基因，获得
FliC
‑
donor
片段；合成
FliC
基因靶点引物，然后利用一步退火法构建含有
FliC
基因靶点的质粒
pTarget
‑
FliC
，经
DpnI
酶切后转化到
E.coli DH5
α
细胞中并提取质粒；最后将
pTarget
‑
FliC
和
FliC
‑
donor
供体片段混合后，电转化
L
‑
阿拉伯糖诱导的含
pCas
的
E.coli DH5
αΔ
tnaA
感受态细菌，于包含
Kan
和
Spe
的
LB
平板上
30℃
培养，筛选获得
tnaA
基因和
FliC
基因双敲除的大肠杆菌
E.coli DH5
αΔ

【专利技术属性】
技术研发人员：卢楠，张光媛，刘佳，陆其聪，
申请(专利权)人：重庆医科大学，
类型：发明
国别省市：