构建高效利用甲酸的大肠杆菌工程菌的方法技术

本发明专利技术公开了一种构建高效利用甲酸的菌株的方法，包括下述步骤：将菌株内在的丝氨酸循环和三羧酸循环途径融合形成一个大循环；加强四氢叶酸循环；削弱竞争代谢途径从而加强甲酸的代谢

【技术实现步骤摘要】
构建高效利用甲酸的大肠杆菌工程菌的方法


[0001]本专利技术属于代谢工程领域，涉及一种构建高效利用甲酸的大肠杆菌工程菌的方法
、
该工程菌的用途
。

技术介绍

[0002]甲酸作为重要的有机一碳化工原料，来源广泛
、
价格低廉
。
同时液态甲酸方便运输
、
水溶性高，可以作为良好的代糖原料
[1
‑
4]。
更为重要的是，甲酸可以通过还原二氧化碳直接获得，并作为碳源供微生物生长
[5
‑
9]。
甲酸已成为一种具有巨大应用潜力的一碳原料
。
然而，目前尚未实现甲酸在发酵工业中的应用，其原因在于微生物对甲酸的代谢能力低
、
耐受性差以及发酵周期长等
[10
‑
13]。
因此，通过人工设计和改造获得高效利用甲酸的微生物是亟待解决的难点和重点
。
[0003]天然的甲酸利用途径可以分为两个类型：一是甲酸被异化成二氧化碳为细胞生长提供还原力
[14]；二是甲酸被生物体同化为细胞提供物质基础
。
甲酸同化途径是利用甲酸与生物体内的其它代谢中间体进行缩合，主要包括两种方式：
(1)
甲酸和四氢叶酸经甲酸
‑
四氢叶酸连接酶
(Formate
‑
tetrahydrofolate ligase
，
FTL)
催化生成甲酰
‑
四氢叶酸，甲酰
‑
四氢叶酸是一种重要的甲基供体，广泛存在于各种物种中，为核酸
、
蛋白质及核苷酸
、
氨基酸的合成提供
(
甲酸来源的
)
碳原子；
(2)
甲酸和乙酰辅酶
A
经丙酮酸
‑
甲酸裂合酶
(Pyruvate
‑
formate lyase
，
PFL)
催化合成丙酮酸
。
虽然体外实验已经证实了
PFL
可以催化甲酸和乙酰辅酶
A
生成丙酮酸
[15]，但是通过体内改造该途径提高细胞同化甲酸能力的研究尚未见报道
。
目前研究者关注并改造的生物体内的天然甲酸同化途径主要是与
FTL
相关联的丝氨酸循环途径
、
还原性乙酰辅酶
A
途径以及还原性甘氨酸途径
。
但是这些天然途径所涉及的酶和中间体的浓度低且不稳定，导致甲酸同化效率较低，还不能满足工业应用的要求
。

技术实现思路

[0004]鉴于上述现有技术和菌株改造策略的不足，专利技术人提出以下猜想：由于丝氨酸循环和三羧酸循环途径同时包含有苹果酸和草酰乙酸这两种中间代谢产物，因此敲除两条途径中各自相关的催化基因即可将两个循环融合形成一个大循环
。
又由于丝氨酸循环本身偶联了四氢叶酸循环，而四氢叶酸循环是甲酸同化的主要代谢通路之一，因此，通过上述的三羧酸和丝氨酸循环的融合，同时加强四氢叶酸循环并削弱竞争代谢途径即可加强甲酸的代谢，提高宿主微生物对甲酸的利用能力
。
专利技术人对这些代谢途径中的相关基因进行了调研，并通过实验证实了上述构思的技术方案可显著提高菌株的甲酸代谢能力
。
这一重要发现构成了本专利技术的基础，对于获得能高效利用甲酸的工程菌具有重要意义，且所获得的工程菌可以作为基因工程领域的宿主菌表达外源基因或代谢产物合成相关途径，应用前景广阔
。
[0005]具体地，本专利技术包括如下技术方案：
[0006]一种构建高效利用甲酸的菌株的方法，包括下述步骤：
[0007]A.
将菌株内在的丝氨酸循环和三羧酸循环途径融合形成一个大循环
(
本文中将其称为
S
‑
TCA
循环
)
，以提高甲酸同化能力，并且
/
或者，
[0008]B.
加强四氢叶酸循环，以促进菌株的甲酸代谢，并且
/
或者，
[0009]C.
削弱竞争代谢途径，得到甲酸代谢加强的工程菌
。
[0010]在一种实施方式中，步骤
A
可以是中断
(
比如敲除
/
缺失
/
失活
)
或下调表达丝氨酸循环和三羧酸循环途径相关基因
mqo、mdh、glcB、aceB、maeB、maeA
中的两个以上
、
三个以上
、
四个以上
、
五个以上或者六个，但不限于此
。
由于丝氨酸循环和三羧酸循环有一步反应是重叠的，因此涉及其中的
mqo
和
mdh
基因既是丝氨酸循环的基因，也是三羧酸循环的基因
。
[0011]步骤
B
可以是使菌株过表达甲酸
‑
四氢叶酸连接酶基因
ftl
，但不限于此
。
[0012]步骤
C
可以是中断
(
比如敲除
/
缺失
/
失活
)
或下调表达丝氨酸合成途径关键基因
serA、serB
和
serC
中的一个
、
两个或三个，并且
/
或者中断
(
比如敲除
/
缺失
/
失活
)
或下调表达甘氨酸裂解途径基因
gcvP、gcvH
和
gcvT
中的一个
、
两个或三个，但不限于此
。
[0013]其中，所述基因的中断包括基因的敲除
、
缺失
、
失活
。
[0014]所述基因的敲除
/
缺失可以通过基因编辑技术实施，所述通过基因编辑技术选自下组：同源双交换，
TALEN
系统，
CRISPR
‑
Cas9
系统，
CRISPR
‑
Cpf1
系统，
CRISPR
‑
Cas12
系统，
CRISPR
‑
BEST
系统，
CRISPRi。
[0015]所述基因的失活选自下组方式：核苷酸序列全部删除，核苷酸序列部分删除，基因突变，阅读框内突变终止密码子
。
[0016]所述基因的下调表达选自下组方式：蛋白泛素化修饰，
RNA
干涉...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种构建高效利用甲酸的菌株的方法，包括下述步骤：
A.
将菌株内在的丝氨酸循环和三羧酸循环途径融合形成一个大循环，并且
/
或者，
B.
加强四氢叶酸循环并且
/
或者，
C.
削弱竞争代谢途径，得到甲酸代谢加强的工程菌
。2.
如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤
A
是中断或下调表达丝氨酸循环和三羧酸循环途径相关基因
mqo、mdh、glcB、aceB、maeB、maeA
中的两个以上
、
三个以上
、
四个以上
、
五个以上或者六个；步骤
B
是使菌株过表达甲酸
‑
四氢叶酸连接酶基因
ftl
；步骤
C
是中断或下调表达丝氨酸合成途径关键基因
serA、serB
和
serC
中的一个
、
两个或三个，并且
/
或者中断或下调表达甘氨酸裂解途径基因
gcvP、gcvH
和
gcvT
中的一个
、
两个或三个
。3.
如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述菌株是大肠杆菌
。4.
如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤
A
中所述丝氨酸循环和三羧酸循环途径相关基因分别是
mqo:b2210、mdh:b3236、glcB:b2976、aceB:b4014、maeB:b2463、maeA:b1479。5.
如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤
B
中所述基因
ftl
是外源基因，选自扭脱甲基杆菌来源的
ftl
基因
(M...

【专利技术属性】
技术研发人员：顾阳，田进忠，何美玉，姜卫红，
申请(专利权)人：中国科学院分子植物科学卓越创新中心，
类型：发明
国别省市：