一种用于细菌中快速响应法尼基焦磷酸制造技术

本发明专利技术公开了一种用于细菌中快速响应法尼基焦磷酸

【技术实现步骤摘要】
一种用于细菌中快速响应法尼基焦磷酸FPP的报告系统、构建方法及其应用


[0001]本专利技术涉及一种用于细菌中快速响应法尼基焦磷酸
FPP
的报告系统
、
构建方法及其应用，并公开了其基因的核苷酸序列
、
氨基酸序列
、
蛋白结构，报告系统在不同
FPP
水平以及不同发酵时间下的响应效果，属于生物工程

。

技术介绍

[0002]异戊二烯类化合物存在于所有生物体中，是最多样化的天然物质之一
。
目前已知至少有
50
，
000
种结构，其中许多结构在医疗和技术应用方面具有巨大潜力
。
在异戊二烯形成的一类最为重要的代谢物：萜烯类化合物中存在一个中心代谢物质：法尼基焦磷酸
FPP
，
FPP
作为合成倍半萜烯的关键性前体，参与包括胡萝卜素
、
番茄红素
、
罗汉果苷等多种高附加值产品
。
[0003]随着生物技术的发展
,
合成生物学受到越来越多的关注
。
通过在微生物底盘细胞中重组天然化合物的生物合成途径，来快速
、
大量的获取天然产物及其中间体，为植物天然活性产物的开发与应用提供了新的方法
。
微生物具有生长速度快
、
发酵周期短
、
发酵成本低的优点，且相对于植物其遗传背景更清楚有利于遗传改造
。
基于这些优点，多种萜烯类化合物已成功在微生物底盘中生产，而想要在微生物底盘中更加高效地进行生产，精准的调控和检测细胞内的
FPP
含量就至关重要，基于这一需求，我们开发了一种使用分裂式荧光蛋白检测
FPP
的方法
。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是构建一种能够在细菌中快速响应法尼基焦磷酸
FPP
的报告系统并将其工业化应用
。
该报告系统由两个独立表达的蛋白
FPPR1
和
FPPR2
构成
。
将两个蛋白以基因簇的形式转化至
E.coli BL21(DE3)
感受态细胞中构建获得
。
[0005]为实现上述目的
,
本专利技术采取的技术方案如下：
[0006]该报告系统通过如下步骤构建获得：
[0007]构建组成性表达
FPPR
的重组质粒：
[0008](1)
分别合成插入了
FPP
结合序列的麦芽糖结合蛋白及其锚定蛋白
,
其核苷酸序列如
SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2
所示，其氨基酸序列如
SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4
所示
。
[0009](2)
分别合成
β
‑
桶蛋白的
N
端以及
C
端序列，其核苷酸序列如
SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6
所示，其氨基酸序列如
SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8
所示
。
[0010](3)
将步骤
(1)
及
(2)
扩增得到的麦芽糖结合蛋白与
β
‑
桶蛋白的
N
端连接
,
获得
FPPR1
；将步骤
(1)
及
(2)
扩增得到的锚定蛋白与
β
‑
桶蛋白的
C
端连接，获得
FPPR2
；
FPPR1、FPPR2
的序列如
SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10
所示
。
[0011](4)
根据具体使用环境，选择具有合适强度的组成性启动子，将
FPPR1、FPPR2
串联表达，并转入用于生产的底盘菌株使用
。
[0012]本专利技术的有益效果是：本专利技术构建的传感器在野生型大肠杆菌
BL21
以及过表达
FPP
生产途径的大肠杆菌
BL21
‑
MVA
中分别验证了可用性，该方法适于工业化生产中
FPP
的实时检测
。
附图说明
[0013]图
1FPPR
重组载体谱图；
[0014]图
2FPPR
结合
FPP
时的结构示意图；
[0015]图
3FPPR
用于检测不同
FPP
水平的菌株；
[0016]图
4FPPR
荧光强度随发酵时间的变化情况
。
具体实施方式
[0017]在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法
。
[0018]一般性说明：实施例所涉及材料包括
RNA
提取试剂盒
、
反转录试剂盒
、
快切酶
、
无缝连接酶
、
质粒试剂盒
、
胶回收试剂盒，但不限于此
。
操作完全按照相应说明书进行
。
[0019]E.coli JM109
感受态细胞
、E.coli BL21(DE3)
感受态细胞按
Competent Cell Preparation Kit
说明书制备
,
具体步骤如下：
[0020]1.
使用无抗性
LB
平板培养基，用接种针挑取大肠杆菌
(
‑
80℃
甘油保存菌
)
，平板培养基上分级划线，上述划线的平板培养基倒置于恒温培养箱中
37℃
过夜培养
。
[0021]2.
在划线平板培养基上挑取单菌落，接种到
20mL
无抗性的
LB
培养基中，
37℃
振荡
(
约
120rpm)
培养
。
测定
OD
600
值，
OD
600
值达到
0.3
～
0.5
时
(
约培养5小时
)
放置冰中停止培养
。
[0022]3.
取步骤
(2)
菌体培养液
1ml
于
1.5mL
离心管中，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种用于细菌中快速响应法尼基焦磷酸
FPP
的报告系统，其特征在于，
(1)
使用麦芽糖结合蛋白及其锚定蛋白作为蛋白质骨架插入
FPP
结合序列；
(2)
使用分裂
β
‑
桶结构用作荧光报告系统；
(3)
分别在麦芽糖结合蛋白
C
端以及锚定蛋白
N
端结合
β
‑
桶结构
。2.
一种权利要求1所述的报告系统的构建方法，其特征在于，构建组成性表达
FPPR
的重组质粒，通过如下步骤构建获得：
(1)
分别合成插入了
FPP
结合序列的麦芽糖结合蛋白及其锚定蛋白
,
其核苷酸序列如
SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2
所示
,
其氨基酸序列如
SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4
所示；
(2)
分别合成
β
‑
桶蛋白的
N
端以及
C
端序列，其核苷酸序列如
SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6
所示，其氨基酸序列如
SEQ ID NO.7、SEQ ID ...

【专利技术属性】
技术研发人员：李思远，尤大伟，王玉祺，
申请(专利权)人：苏州微星博生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：