一种改造后的制造技术

本发明专利技术提供了一种改造后的

【技术实现步骤摘要】
一种改造后的APaH基因在提高外源基因表达活性中的应用


[0001]本专利技术涉及分子生物
，具体是一种改造后的
APaH
基因在提高外源基因表达活性中的应用
。

技术介绍

[0002]蛋白质的外源表达在科学研究以及工业化生产等多个领域都有着广泛的应用，大肠杆菌表达系统是最早被采用和进行研究的表达系统，也是目前掌握最为成熟的表达系统
。
大肠杆菌表达系统以其细胞繁殖快速
、
产量高
、IPTG
诱导表达相对简便等优点成为生产重组蛋白的最常用的系统，其特点是表达背景清楚
、
表达水平高
、
操作简单
、
培养周期短且抗污染能力强，目前商品化的载体和菌株种类非常齐全
、
适用范围广
。
[0003]提高外源蛋白基因表达效率能够实现蛋白质表达水平的显著提高，公开号为“CN112980877A”的专利技术专利申请中提供了一种在细胞培养实验中提高外源基因表达效率的方法，利用转基因技术，在外源转染表达目的基因的同时，共转染
BRAF
表达载体，激活
MAPK/ERK
信号通路，进而激活
mTOR
信号通路，激活的
mTOR
则会磷酸化激活
RPS6
，从而促进带有
TOP
序列的靶基因的翻译效率，最终极大程度地提高外源基因的表达效率
。
[0004]目前虽然已有多种用于提高外源蛋白基因表达活性的方法，但多集中于质粒系统及其所携带基因的改造，涉及大肠杆菌基因组的调整较少，提高外源蛋白基因表达活性仍有进一步研究的必要性
。
[0005]APaH
基因存在于大肠杆菌
E.coli BL21(DE3)
中，其编码二腺苷四磷酸酶，该酶能够将
5',5
”‑
P1,P4
二腺苷四磷酸
(AppppA)
水解为两分子二磷酸腺苷
(ADP)
，而二腺苷四磷酸存在于从古细菌到人类的所有活细胞中，并一直被认为是原核生物和真核生物的胞内警报分子；在细胞内，二腺苷四磷酸酶影响
DNA
修复
、RNA
编程
、
细胞分化
、
热激和氧分压
、
凋亡和转录调控等生物过程
。

技术实现思路

[0006]本专利技术提供了一种改造后的
APaH
基因在提高外源基因表达活性中的应用，通过对大肠杆菌
BL21(DE3)
中的二腺苷四磷酸酶编码基因
APaH
进行改造以灭活二腺苷四磷酸酶，可有效提高外源基因在大肠杆菌
BL21(DE3)
中的表达活性
。
[0007]本专利技术技术方案如下：
[0008]一种改造后的
APaH
基因在提高外源基因表达活性中的应用，所述
APaH
基因编码二腺苷四磷酸酶
。
[0009]优选的，应用方法是利用改造后的
APaH
基因使二腺苷四磷酸酶灭活，以提高外源基因表达活性
。
[0010]优选的，所述
APaH
的核苷酸序列如
SEQ ID NO.1
所示，对
APaH
进行改造后的核苷酸序列如
SEQ ID NO.2
所示
。
[0011]优选的，所述改造的方法是利用
CRISPR
基因编辑技术对
APaH
基因进行改造
。
[0012]优选的，具体包括如下步骤：
[0013](1)
设计基因突变用同源臂引物：根据
APaH
的大小分别设计上游同源臂引物
F1
和
R1
和下游同源臂引物
F2
和
R2
；
[0014](2)
制备
Donor DNA
：分别使用步骤
(1)
中的
F1
和
R1
扩增
APaH
的上游同源臂，使用
F2
和
R2
扩增
APaH
的下游同源臂；然后利用重叠
PCR
方法将上游同源臂和下游同源臂连接，得线性基因片段
Donor DNA
‑
APaHM
；
[0015](3)pTargetF
‑
APaH
质粒的构建：以
pTargetF
质粒作为模板，使用引物
F3
和
R3
反向
PCR
扩增
pTargetF
质粒，将扩增产物利用试剂盒进行回收纯化，得到携带有靶向目的基因
N20
序列
(GCTGGAAGGCAAAGGTACGC)
的
pTargetF
‑
APaH
线性基因片段；将
pTargetF
‑
APaH
线性基因片段转化进大肠杆菌
DH5
α
感受态细胞中完成环化，并提取得
pTargetF
‑
APaH
质粒；
[0016](4)pCas
质粒转化：按照顺序在电转杯中依次加入
pCas
质粒2μ
L
和大肠杆菌
BL21(DE3)
感受态细胞
50
μ
L
，进行电转；电转成功后向电转杯中加入
LB
液体培养基
950
μ
L
，充分混匀后全部转移至
1.5mL
离心管中，
30
±
1℃、180
～
220r/min
培养
1.5
～
2.5h
，得菌液1；将菌液1梯度涂布到
LB+Kan
抗性固体培养基上，
30℃
培养至长出单菌落；挑取单菌落制备感受态细胞，得携带有
pCas
质粒的大肠杆菌
BL21(DE3)
感受态细胞；
[0017](5)Donor DNA
‑
APaHM
和
pTargetF
‑
APaH
质粒共转化：按照顺序在电转杯中依次加入步骤
(3)
制备的
pTargetF
‑
APaH
质粒2μ
L、
步骤
(2)
制备的
Donor DNA
‑<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种改造后的
APaH
基因在提高外源基因表达活性中的应用，所述
APaH
基因编码二腺苷四磷酸酶
。2.
如权利要求1所述的应用，其特征在于，应用方法是利用改造后的
APaH
基因使二腺苷四磷酸酶灭活，以提高外源基因表达活性
。3.
如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述
APaH
的核苷酸序列如
SEQ ID NO.1
所示，对
APaH
进行改造后的核苷酸序列如
SEQ ID NO.2
所示
。4.
如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述改造的方法是利用
CRISPR
基因编辑技术对
APaH
基因进行改造
。5.
如权利要求4所述的应用，其特征在于，具体包括如下步骤：
(1)
设计基因突变用同源臂引物：根据
APaH
的大小分别设计上游同源臂引物
F1
和
R1
和下游同源臂引物
F2
和
R2
；
(2)
制备
Donor DNA
：分别使用步骤
(1)
中的
F1
和
R1
扩增
APaH
的上游同源臂，使用
F2
和
R2
扩增
APaH
的下游同源臂；然后利用重叠
PCR
方法将上游同源臂和下游同源臂连接，得线性基因片段
Donor DNA
‑
APaHM
；
(3)pTargetF
‑
APaH
质粒的构建：以
pTargetF
质粒作为模板，使用引物
F3
和
R3
反向
PCR
扩增
pTargetF
质粒，将扩增产物利用试剂盒进行回收纯化，得到携带有靶向目的基因
N20
序列
(GCTGATAACCGTGACAACGG)
的
pTargetF
‑
APaH
线性基因片段；将
pTargetF
‑
APaH
线性基因片段转化进大肠杆菌
DH5
α
感受态细胞中完成环化，并提取得
pTargetF
‑
APaH
质粒；
(4)pCas
质粒转化：按照顺序在电转杯中依次加入
pCas
质粒2μ
L
和大肠杆菌
BL21(DE3)
感受态细胞
50
μ
L
，进行电转；电转成功后向电转杯中加入
LB
液体培养基
950
μ
L
，充分混匀后全部转移至
1.5mL
离心管中，
30
±
1℃、180
～
220r/min
培养
1.5
～
2.5h
，得菌液1；将菌液1梯度涂布到
LB+Kan
抗性固体培...

【专利技术属性】
技术研发人员：汪俊卿，王馨宇，孙初颖，方轲，董子杨，高昇，李尚昱，吴静雯，李丕武，王瑞明，王婷，苏静，
申请(专利权)人：齐鲁工业大学山东省科学院，
类型：发明
国别省市：