一种拟南芥制造技术

本发明专利技术提供了一种拟南芥

【技术实现步骤摘要】
一种拟南芥ZAR1蛋白体外表达的方法及其应用


[0001]本专利技术涉及基因工程
，特别涉及一种拟南芥
ZAR1
蛋白体外表达的方法及其应用
。

技术介绍

[0002]拟南芥
(Arabidopsis thaliana)
是植物生物学研究的重要模式生物，对于研究植物免疫系统的机制具有重要意义
。
拟南芥被称为“植物中的果蝇”，其基因组是目前已知植物基因组中最小的，且是自花授粉植物，基因高度纯合，用理化因素处理后突变率很高，容易获得各种代谢功能的缺陷型
。ZAR1
是拟南芥中的重要免疫受体之一，其能够识别并响应细菌致病因子，从而引发植物免疫反应，为探究植物抵御病原菌的机制提供了重要线索
。
[0003]原核表达系统是目前广泛应用于蛋白质表达及纯化的技术
。
其具有操作简便
、
培养条件简单
、
大量高效表达蛋白等优点，被广泛应用于各类实验室
。
利用原核表达系统，可以大量高效地表达目的蛋白，并进行后续的纯化和鉴定
。
同时，原核表达系统还能够提供一些特定的修饰，如结构域的标记或标签等，使得蛋白质表达和纯化更加方便和准确
。
因此，构建拟南芥
ZAR1
原核表达载体，实现对该免疫受体基因的高效表达，对研究
ZAR1
基因的生物学功能具有重要意义
。

技术实现思路

[0004]有鉴于此，本专利技术目的在于提供一种拟南芥
ZAR1
蛋白体外表达的方法及其应用，本专利技术提供的拟南芥
ZAR1
蛋白体外表达的方法可以成功构建拟南芥
ZAR1
蛋白的原核表达重组菌株，表达
ZAR1
蛋白，且表达的
ZAR1
蛋白具有高度的纯度和活性
。
[0005]为了实现上述目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0006]一种拟南芥
ZAR1
蛋白体外表达的方法，包括以下步骤：
[0007]S1、
提取拟南芥基因组
DNA
，反转录成
cDNA
，以
cDNA
为模板扩增
ZAR1
基因；
[0008]S2、
构建拟南芥
ZAR1
蛋白的大肠杆菌原核表达重组质粒；
[0009]S3、
将
S2
中所得的原核表达重组质粒转化到大肠杆菌
BL21(DE3)
中，构建拟南芥
ZAR1
蛋白的原核表达重组菌株；
[0010]S4、
恒温培养
S3
中的原核表达重组菌株，分离提取
ZAR1
蛋白；
[0011]S5、ZAR1
蛋白的纯化
、
鉴定
。
[0012]优选地，所述
S1
中扩增
ZAR1
基因所用的引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如
SEQ ID NO.1
所示，所述反向引物的核苷酸序列如
SEQ ID NO.2
所示
。
[0013]优选地，所述正向引物中包含
BamHI
酶切位点，反向引物中包含
EcoRI
酶切位点
。
[0014]优选地，所述
S2
中构建拟南芥
ZAR1
蛋白的大肠杆菌原核表达重组质粒中所使用的原核表达载体为
pET28a。
[0015]优选地，所述
S3
中的转化为电转化或热激法转化
。
[0016]优选地，所述
S4
中的恒温培养为
35℃
～
38℃、180rpm
～
210rpm
摇床培养至
OD
600
值
为
0.6
～
0.8。
[0017]优选地，所述
S4
中的分离提取为：裂解
、
破碎
。
[0018]优选地，所述
S5
中
ZAR1
蛋白的纯化为亲和层析
、
凝胶过滤
、
离子交换层析中的一种进行纯化；鉴定为：制备
12
％分离凝胶和5％堆积凝胶，
200V、60min
电泳，考马斯亮蓝染色
。
[0019]本专利技术还提供一种上述技术方案中所述拟南芥
ZAR1
蛋白体外表达的方法所得的
ZAR1
蛋白
。
[0020]本专利技术还提供一种上述技术方案中所述的
ZAR1
蛋白的应用
。
[0021]有益技术效果：本专利技术提供了一种拟南芥
ZAR1
蛋白体外表达的方法及其应用，拟南芥
ZAR1
蛋白体外表达的方法，包括以下步骤：提取拟南芥基因组
DNA
，反转录成
cDNA
，以
cDNA
为模板扩增
ZAR1
基因；构建拟南芥
ZAR1
蛋白的大肠杆菌原核表达重组质粒；将所得的原核表达重组质粒转化到大肠杆菌
BL21(DE3)
中，构建拟南芥
ZAR1
蛋白的原核表达重组菌株；恒温培养原核表达重组菌株，分离提取
ZAR1
蛋白；
ZAR1
蛋白的纯化
、
鉴定
。
本专利技术提供的方法可以成功构建拟南芥
ZAR1
蛋白的原核表达重组菌株，表达
ZAR1
蛋白，且表达的
ZAR1
蛋白具有高度的纯度和活性
。
附图说明
[0022]图1为扩增的
pT
‑
ZAR1
基因的电泳图；
[0023]图2为原核表达载体
pET28a
的质粒的电泳图；
[0024]图3为原核表达载体
pET28a
与
ZAR1
的双酶切产物的电泳图；
[0025]图4为
pET28a
‑
ZAR1
转化子的
PCR
鉴定结果；
[0026]图5为重组质粒
pET28a
‑
ZAR1
的电泳图；
[0027]图6为
E.coli BL21(DE3)
中
pET28a
‑
ZAR1
质粒的电泳图
。
具体实施方式
[0028]本专利技术提本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种拟南芥
ZAR1
蛋白体外表达的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、
提取拟南芥基因组
DNA
，反转录成
cDNA
，以
cDNA
为模板扩增
ZAR1
基因；
S2、
构建拟南芥
ZAR1
蛋白的大肠杆菌原核表达重组质粒；
S3、
将
S2
中所得的原核表达重组质粒转化到大肠杆菌
BL21(DE3)
中，构建拟南芥
ZAR1
蛋白的原核表达重组菌株；
S4、
恒温培养
S3
中的原核表达重组菌株，分离提取
ZAR1
蛋白；
S5、ZAR1
蛋白的纯化
、
鉴定
。2.
根据权利要求1所述拟南芥
ZAR1
蛋白体外表达的方法，其特征在于，所述
S1
中扩增
ZAR1
基因所用的引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如
SEQ ID NO.1
所示，所述反向引物的核苷酸序列如
SEQ ID NO.2
所示
。3.
根据权利要求2所述拟南芥
ZAR1
蛋白体外表达的方法，其特征在于，所述正向引物中包含
BamHI
酶切位点，反向引物中包含
EcoRI
酶切位点
。4.
根据权利要求1所述拟南芥
ZAR1
蛋白体外表达的方法，其特征在于，所述
...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖文婕，
申请(专利权)人：肖文婕，
类型：发明
国别省市：