一种高效构建制造技术

本发明专利技术公开了一种高效构建

【技术实现步骤摘要】
一种高效构建gRNA的方法


[0001]本专利技术属于基因编辑
，具体涉及一种高效构建
gRNA
的方法
。

技术介绍

[0002]Clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR)/CRISPR
‑
associated protein(Cas)
是古细菌或细菌中特有的一种获得性免疫系统
。
研究人员将其开发成基因编辑工具之后，凭借其高效
、
精准
、
通用性强等优点迅速成为合成生物学领域的热门研究方向，在生命科学
、
生物工程技术
、
食品科学及农作物育种等多个领域引发了革命性的影响
。CRISPR/Cas
系统在进行基因编辑时，只需要
20bp
的
space
就可以实现精准定位和基因编辑，因此除
CRISPR/Cas
系统本身进化以提高
CRISPR/Cas
系统的基因编辑效率和降低脱靶率之外，高效的
gRNA
质粒构建方法也是科研人员一直在探索的一个方向
。
[0003]现在主流的
gRNA
构建方法主要分为两种：一种是通过设计两对引物分别
PCR
扩增得到线性化载体和插入片段，使扩增得到的线性化的片段和模板质粒大小差距较大，可以使用琼脂糖凝胶电泳将模板质粒和线性化片段进行分开，然后通过
T5
连接酶
、Gibson
或
Golden Gate
方法进行连接，此方法在进行
gRNA
质粒构建时，需要进行两次
PCR
及两次胶回收，然后再进行两片段的连接；另一种方法是使用单对引物对
PCR
产物进行线性化，只需要进行一次
PCR
，但是因为模板和线性化片段差距太小，无法使用凝胶电泳的方法将其分开，因此要使用消化模板的酶
(
如
DpnI)
，但是受到市场上常用的消化模板方法的影响，进行模板消化时会出现模板消化不彻底并且线性化片段损失量较大的问题，并且模板消化时间也较长；现在常用的
gRNA
构建除了构建过程复杂之外，还因其无特殊的筛选标签或者无合适的筛选方法，在进行后续操作之前还要进行基因测序，以保证
gRNA
已经实现成功构建，不管是时间成本还是物质成本都是巨大的
。

技术实现思路

[0004]鉴于此，本专利技术的目的在于提供了一种高效构建
gRNA
的方法，本专利技术利用反向筛选的方法，将反向筛选基因和
gRNA
质粒结合，提供了一种高效的
gRNA
构建方法，本专利技术提供的
gRNA
构建的方法只需要简单的引物设计和一次
PCR
产物扩增，无需进行琼脂凝胶电泳，并且由于反向筛选基因的存在不需要对质粒模板进行消化，只需要使用
PCR
回收试剂盒进行
PCR
产物纯化后就可直接用于后续线性化
PCR
环化步骤，将上述
PCR
产物进行连接，如使用
Gibson
方法进行连接构建成一个完整的质粒，然后通过电转或化转的方法将其导入到目的菌株，复苏后将其涂布于反向筛选基因对应的筛选平板上，在筛选平板上正常生长的菌落即为含有构建成功的
gRNA
质粒菌种
。
使用本专利技术构建的
gRNA
质粒，可以大幅度提高构建效率并且减少送测序的个数以降低质粒构建成本
。
[0005]为达到上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
[0006]本专利技术提供一种高效构建
gRNA
的方法，包括以下步骤：
[0007](1)
针对
Cas9
：构建模板质粒，以
sacB、ccdB、nfsI
基因为反向筛选基因，以常规的
gRNA
质粒模板作为骨架结构，使用
T5
连接酶
、Gibson、Golden Gate
方法将反向筛选基因和骨架结构进行连接，形成一个完整质粒，以得到的质粒为模板，使用正向引物5’‑
NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG
‑3’
和反向引物5’‑
NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNACTAGTATTATACCTAGGAC TGAG
‑3’
对模板进行
PCR
扩增，其中
20bp
的
N
表示需要构建的
gRNA
质粒的
space
序列；
[0008]针对
Cas12a
：构建模板质粒，以
sacB、ccdB、nfsI
基因为反向筛选基因，以常规的
gRNA
质粒模板作为骨架结构，使用
T5
连接酶
、Gibson、Golden Gate
方法将反向筛选基因和骨架结构进行连接，形成一个完整质粒，以得到的质粒为模板，使用正向引物5’‑
NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNATCTACAAGAGTAGAAATTAAAAAGGTCTTTTG
‑3’
和反向引物5’‑
NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGGATCCAGCATATGCGGTG
‑3’
对模板进行
PCR
扩增，其中
20bp
的
N
表示需要构建的
gRNA
质粒的
space
序列；
[0009](2)
将步骤
(1)
得到的
PCR
产物使用
PCR
产物纯化试剂盒进行纯化；
[0010](3)
将步骤
(2)
得到的
PCR
产物进行
PCR
产物自身环化，构建成环形质粒；
[0011](4)
将步骤
(3)
构建的环形质粒转入到感受态细胞中，复苏后涂布于含有反向筛选标签相互作用物质的平板上，培养过夜；
[0012](5)
平板上生长出来的菌株均为含有构建成功的
gRNA
质粒的菌株
。
[0013]基于上述技术方案，进一步地，步骤
(1)
中所述的常规的
gRNA
质粒包括
pDY
和
pUC19
；
[0014]针对
Cas9...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种高效构建
gRNA
的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)
针对
Cas9
：构建模板质粒，以
sacB、ccdB、nfsI
基因为反向筛选基因，以常规的
gRNA
质粒模板作为骨架结构，使用
T5
连接酶
、Gibson、Golden Gate
方法将反向筛选基因和骨架结构进行连接，形成一个完整质粒，以得到的质粒为模板，使用正向引物5’‑
NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG
‑3’
和反向引物5’‑
NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNACTAGTATTATACCTAGGAC TGAG
‑3’
对模板进行
PCR
扩增，其中
20bp
的
N
表示需要构建的
gRNA
质粒的
space
序列；针对
Cas12a
：构建模板质粒，以
sacB、ccdB、nfsI
基因为反向筛选基因，以常规的
gRNA
质粒模板作为骨架结构，使用
T5
连接酶
、Gibson、Golden Gate
方法将反向筛选基因和骨架结构进行连接，形成一个完整质粒，以得到的质粒为模板，使用正向引物5’‑
NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNATCTACAAGAGTAGAAATTAAAAAGGTCTTTTG
‑3’
和反向引物5’‑
NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGGATCCAGCATATGCGGTG
‑3’
对模板进行
PCR
扩增，其中
20bp
的
N
表示需要构建的
gRNA
质粒的
space
序列；
(2)
将步骤
(1)
得到的
PCR
产物使用
PCR
产物纯化试剂盒进行纯化；
(3)
将步骤
(2)
得到的
PCR
产物进行
PCR
产物自身环化，构建成环形质粒；
(4)
将步骤
(3)
构建的环形质粒转入到感受态细胞中，复苏后涂布于含有反向筛选标签相互作用物质的平板上，培养过夜；
(5)
平板上生长出来的菌株均为含有构建成功的
gRNA
质粒的菌株
。2.
根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤
(1)
中所述的常规的
gRNA
质粒包括
pDY
和
pUC19
，针对
Cas9
：
pDY<...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘嵘明，梁丽亚，樊祥瑞，
申请(专利权)人：大连理工大学，
类型：发明
国别省市：