重组亲和素的构建工艺和应用制造技术

重组亲和素的构建工艺，它涉及重组链霉亲和素技术领域，具体设计一种重组亲和素的构建工艺和应用。它包括以下步骤：步骤一：序列设计，利用NCBI获取链霉亲和素编码基因，对链霉亲和素进行同源性分析，确定拟克隆序列以及对应的蛋白序列，将拟克隆序列以及对应的蛋白序列插入载体上，获得重组质粒；步骤二：重组链霉亲和素的诱导表达及菌体破裂；步骤三：重组链霉亲和素的纯化及纯度分析。采用上述技术方案后，本发明专利技术有益效果为：实现了蛋白的可溶性表达，且提高了表达量，降低了杂蛋白含量；保证了蛋白纯化效果，结合不牢固的杂蛋白几乎完全洗下，目的蛋白几乎没有挂柱现象，几乎完全洗脱，结合牢固的杂蛋白洗脱量少，得到蛋白纯度高。得到蛋白纯度高。得到蛋白纯度高。

【技术实现步骤摘要】
重组亲和素的构建工艺和应用


[0001]本专利技术涉及重组链霉亲和素
，具体涉及一种重组亲和素的构建工艺和应用。

技术介绍

[0002]链霉亲和素是一种由阿维丁链霉菌分泌的四聚体蛋白，天然全长的SA每条单体肽链由169个氨基酸组成，分子量为16.5KDa，四聚体分子量66KDa。链霉亲和素是目前已知最稳定的蛋白质之一，在高温、强酸、强碱、蛋白水解酶、变性剂存在的环境下耐受性好，仍可以保持活性，且结合了生物素的链霉亲和素具有更好的稳定性。链霉亲和素由于可以高度特异地与D
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生物素结合，使得SA
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生物素系统具有高亲和力、灵敏度高、特异性强、稳定性好的特点，且具备了信号逐级放大的功能，在免疫检测、分子生物学等多种生物医学实验中有广泛的应用。
[0003]但目前重组链霉亲和素大多数以包涵体的形式表达，其复性过程复杂，操作繁琐，消耗大量时间精力，且试剂成本高昂。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于针对现有技术的缺陷和不足，提供一种重组亲和素的构建工艺和应用，它通过pET系统以本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.重组亲和素的构建工艺，其特征在于：它包括以下步骤：步骤一：序列设计，利用NCBI获取链霉亲和素编码基因，对链霉亲和素进行同源性分析，确定拟克隆序列以及对应的蛋白序列，将拟克隆序列以及对应的蛋白序列插入载体上，获得重组质粒；步骤二：重组链霉亲和素的诱导表达及菌体破裂；利用热激法将重组质粒转化入细胞中，在30
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50℃下培养过夜，在过夜培养的转化平板中挑取单菌落，培养并诱导表达，得到菌液A；在菌液A中加入0
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1mM的异丙基硫代半乳糖苷，在18
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37℃下培养4
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8h，将重组蛋白以可溶性蛋白形式表达；提取表达菌株，将表达菌株扩大培养；培养一段时间后收集菌体，获得菌液B，在菌液B中加入平衡缓冲液洗涤菌体，再次重悬，重悬一段时间后，加入PMSF，通过超声波细胞破碎机对菌体进行超声破碎，破碎过程中菌体要进行冰浴，再使用离心机进行离心收集上清，使用滤膜过滤上清溶液；步骤三：重组链霉亲和素的纯化及纯度分析，用去离子水平衡蛋白纯化仪，将层析柱连接到系统中再用5倍柱体积去离子水清洗Ni IDA Beads 6FF填料；使用平衡缓冲液平衡亲和层析柱，仪器调零，将超声破碎后的上清溶液上柱；用洗杂缓冲液清洗柱子和杂蛋白至紫外吸收达到一个稳定的基线；用洗脱缓冲液进行线性洗脱，收集紫外吸收信号升高处流出的所有部分；将收集的目的蛋白在透析缓冲液中过夜透析，适量分装蛋白溶液储存于
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20℃；对超声破碎后的上清溶液、上清过柱后的流穿液、洗杂液、以及纯化后的洗脱液分别取样，进行聚丙烯酰胺凝胶(SDS
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PAGE)电泳。2.根据权利要求1所述的重组亲和素的构建工艺，其特征在于：所述步骤二中的细胞为E.coli BL21(DE3)感受态细胞。3.根据权利要求1所述的重组亲和素的构建工艺，其特征在于：所述步骤二中的转化平板中含有卡那霉素。4.根据权利要求1所述的重组亲和素的构建工艺，其特征在于：所述步骤二中菌液A的OD为600时加入异丙基硫代半乳糖苷。5.根据权利要求1所述的重组亲和素的构建工艺，其特征在于：所述步骤二中超声波细胞破碎机工作时间为60分钟，功率为300W，工作状态为工作3秒，暂停3秒。6.根据权...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈川，周小曼，孙康成，
申请(专利权)人：深圳赛柏生物有限公司，
类型：发明
国别省市：