用于生产制造技术

本发明专利技术提供了一种用于生产

【技术实现步骤摘要】
用于生产L
‑
酪氨酸的重组表达载体、重组工程菌及其构建方法


[0001]本专利技术属于基因工程和生物转化的

。
具体地，本专利技术涉及一种用于生产
L
‑
酪氨酸的重组表达载体
、
重组工程菌及其构建方法
。

技术介绍

[0002]酪氨酸
(Tyrosine
；
Tyr)
，化学名为2‑
氨基
‑3‑
对羟苯基丙酸，是一种含有酚羟基的芳香族极性
α
‑
氨基酸，分子式为
C9H
11
NO3，其相对分子量为
181.18900
，溶于酸和碱，不溶于乙醚和乙醇，结构式如下：
[0003][0004]L
‑
酪氨酸是动物体内合成蛋白质所需要的重要氨基酸之一，对人和动物的生长发育和新陈代谢起着重要的作用，其广泛应用于食品
、
饲料
、
医药和化妆品领域
。
在食品领域，
L
‑
酪氨酸是一种重要的食品添加剂；在医药领域，
L
‑
酪氨酸常作为营养增补剂
、
苯丙酮尿症患者的必需氨基酸以及
L
‑
多巴
、
对羟基肉桂酸和对羟基苯乙烯等医药产品的制备原料；在化妆品领域，
L
‑
酪氨酸的盐类产品可有效地缓解黑色素的生成r/>。
[0005]目前制备
L
‑
酪氨酸的方法主要有水解法
、
发酵法和合成法
。
蛋白质水解提取法是目前生产
L
‑
酪氨酸的主要方法之一，其利用天然蛋白质资源经水解
、
脱色和精制等步骤提取
L
‑
酪氨酸
。
提取法的缺点是蛋白的基础成分含有各种天然氨基酸，从中分离出高纯度的
L
‑
酪氨酸比较困难，造成目标产物收率不高；化学合成法的产品为外消旋
DL
‑
酪氨酸，须进一步拆分得到
L
‑
酪氨酸，存在步骤繁琐
、
能耗高及对设备要求高等缺点
。
直接发酵法由于工艺要求而发酵周期较长
、
糖酸转化率低，进而导致生产成本高的问题，不具备市场竞争力
。
[0006]酶转化法由于其专一性强
、
催化效率高
、
反应条件温和
、
反应周期短
、
产物易于分离等优点，逐渐成为
L
‑
酪氨酸合成的重要途径
。
目前合成
L
‑
酪氨酸所用到的酶主要有酪氨酸酚裂解酶
、
酪氨酸酶和转氨酶等
。
酶法合成酪氨酸以丙酮酸
、
苯酚和氨为原料；或者以丝氨酸和苯酚为原料；或者以甘氨酸
、
甲醛和苯酚为原料
。
研究较多的
、
具有较高酶活的酪氨酸酚裂解酶
(TPL)
主要来自于微生物草生欧文氏菌
(Erwinia herbicola)、
中间柠檬酸菌
(Citrobacter intermedius)、
弗氏柠檬酸菌
(Citrobacter freundii)
以及嗜热菌
(Symbiobacterium toebii)
等
。
[0007]苯酚是合成
L
‑
酪氨酸的重要原料，但由于其为三类致癌物，因此在
L
‑
酪氨酸的生产过程中需严格控制苯酚残留
。
但由于在酶转化过程中产品
L
‑
酪氨酸不断析出，会存在苯酚与
L
‑
酪氨酸键合并被包裹的情况，导致转化粗品中苯酚含量较高，需要在精制过程中除
去苯酚，以保证成品的苯酚残留合格
。
[0008]2018
年，冯志彬等人将来源于
Erwinia herbicola
的酪氨酸酚裂解酶基因和信号肽基因共表达，并转化大肠杆菌感受态细胞，构建信号肽介导的酪氨酸酚裂解酶胞外分泌工程菌，其酶释放量达到
50
％以上，总酶活较普通表达提高
36
％
。
[0009]CN105886450A
公开了一种胞内表达酪氨酸酚裂解酶工程菌及其构建方法与应用，专利技术人为了克服蛋白表达量低，容易生产包涵体的缺点，将目的蛋白与伴侣蛋白进行共表达，提高了蛋白表达量和酶活
。
[0010]CN105969819A
公开了一种
L
‑
酪氨酸的生产方法，其在丙酮酸发酵后期加入
β
‑
酪氨酸酶
、
苯酚和氯化铵，将生成的丙酮酸转化为
L
‑
酪氨酸，得到含
L
‑
酪氨酸的发酵液，再经酸溶
、
活性炭脱色
、
陶瓷膜过滤和保安过滤器过滤后，将清液碱析得到
L
‑
酪氨酸
。
该方法在丙酮酸发酵后期加入的原料苯酚有一定毒性，对反应过程控制要求较高，苯酚补加速率小于等于
17.5g/L
·
h。
[0011]CN114560783A
公开了一种
L
‑
酪氨酸的提取方法，其包括转化液碱溶后经陶瓷膜过滤，盐酸中和离心后再次酸溶后活性炭脱色，氨水中和，离心收集精品
。
成品收率为
90.6
％
‑
91.2
％
。
该方法需要二次重结晶得到成品
。
[0012]CN109929889A
公开了一种
L
‑
酪氨酸的制备方法，其以
L
‑
丙氨酸
、
苯酚为原料，以
D
‑
氨基酸氧化酶
、
丙氨酸消旋酶
、
过氧化氢酶
、
酪氨酸酚裂解酶为催化剂，以含氧气体为氧化剂，多酶偶联合成
L
‑
酪氨酸
。
该方法需同时使用四种酶作为催化剂，反应过程需兼顾各种酶的最适温度
、pH
值等参数，影响后期产品的精制纯化
。
[0013]综上，目前的利用酶转化法生产
L
‑
酪氨酸的工艺尚存在以下问题：
[0014](1)
重组表达菌胞内酶需要细胞破本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种重组表达载体，其包含酪氨酸酚裂解酶编码基因和展示基元编码基因，其中所述展示基元编码基因为细菌自转运蛋白基因
。2.
根据权利要求1所述的重组表达载体，其中所述展示基元编码基因为大肠杆菌
(K
‑
12)
自转运蛋白
Ag43
基因；优选地，所述展示基元编码基因的核苷酸序列如
SEQ ID NO.2
所示，或者为与
SEQ ID NO.2
所示的核苷酸序列具有
70
％以上，例如
70
％
、75
％
、80
％
、85
％
、90
％
、91
％
、92
％
、93
％
、94
％
、95
％
、96
％
、97
％
、98
％或
99
％的同源性并保持其表达产物的自转运蛋白活性的核苷酸序列；优选地，所述酪氨酸酚裂解酶编码基因为草生欧文氏菌
(Erwinia herbicola)
的酪氨酸酚裂解酶基因；优选地，所述酪氨酸酚裂解酶编码基因的核苷酸序列如
SEQ ID NO.1
所示，或为与
SEQ ID NO.1
所示的核苷酸序列具有
70
％以上，例如
70
％
、75
％
、80
％
、85
％
、90
％
、91
％
、92
％
、93
％
、94
％
、95
％
、96
％
、97
％
、98
％或
99
％的同源性并保持其表达产物的酪氨酸酚裂解酶活性的核苷酸序列
。3.
根据权利要求1或2所述的重组表达载体，其中所述重组表达载体的起始载体选自
pET
质粒和
pBAD
质粒中的任一种或其组合；优选地，所述
pET
质粒为
pET28a
质粒和
/
或
pET3a
质粒；优选地，所述
pBAD
质粒选自
pBAD HisA、pBAD30、pGEX 2T、pXMJ19
和
pecxk99e
中的任一种或其组合；更优选地，所述重组表达载体的起始载体为
pET28a
质粒
。4.
一种重组工程菌，其包含根据权利要求1至3中任一项所述的重组表达载体
。5.
根据权利要求4所述的重组工程菌，其中所述重组工程菌的宿主细胞为原核细胞；优选地，所述宿主细胞为大肠杆菌；更优选地，所述宿主细胞为大肠杆菌
BL21(DE3)。6.
一种根据权利要求4或5所述的重组工程菌的构建方法，其包括以下步骤：将根据权利要求1至3中任一项所述的重组表达载体导入宿主细胞，得到所述重组工程菌
。7.
根据权利要求6所述的构建方法，其中将酪氨酸酚裂解酶编码基因和展示基元编码基因串联连接到起始载体中，得到所述重组表达载体
。8.
一种

【专利技术属性】
技术研发人员：渠雪梅，田宁，申术霞，于璐，赵芬，余伟，李哲，
申请(专利权)人：河北远大九孚生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：