一种制备L-瓜氨酸的方法技术

本发明专利技术公开了一种制备L

【技术实现步骤摘要】
一种制备L
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瓜氨酸的方法


[0001]本专利技术涉及微生物发酵领域，尤其涉及一种制备L
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瓜氨酸的方法。

技术介绍

[0002]L
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瓜氨酸是一种重要的双基氨基酸，被称为机体内运输和贮存氨基酸的重要载体，在肌肉代谢中极为重要。L
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瓜氨酸可以使人的血管松弛，不仅可用于增强男性性功能、治疗性功能障碍、维护肺功能的健康以及提高脑力清晰度，还有助于脑神经细胞发挥贮藏与调回讯息的功能。人体内合成L
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瓜氨酸的能力较低，需要从食物中补充部分L
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瓜氨酸。
[0003]目前瓜氨酸主要生产方法有化学合成法、提取法、发酵法和酶转化法等。化学合成法是在碱性条件下水解精氨酸得到瓜氨酸，但使用该法生成的产物中含有D
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瓜氨酸杂质，不易去除，且生产过程污染大；提取法主要是从西瓜、核桃仁以及葫芦科植物种子中分离，但这些植物种子中瓜氨酸含量较少，因此提取法受到原料来源的限制较大，生产规模小，产酸率低，成本高，很难进行工业化推广；发酵法是以葡萄糖为原料，利用微生物菌株发酵生产L
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瓜氨酸，即使该方法已经相对成熟，但高产菌株的选育还需要进一步的研究，同时发酵过程不易控制；酶转化法是利用微生物菌体中的精氨酸脱亚胺酶催化L
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精氨酸转化生成L
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瓜氨酸，工艺简单、成本低、产物纯度高。
[0004]现有技术中，酶转化法生产L
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瓜氨酸的过程中，一般以成品精氨酸为原料，在精氨酸脱亚胺酶催化作用下转化生成L
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瓜氨酸。专利CN106496075B使用L
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精氨酸进行转化，但想要取得L
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精氨酸需对精氨酸发酵液进行提取、纯化处理，该过程需大量人工、动能投入；L
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精氨酸转化前需要对其进行溶解并加入盐酸调节pH，由于L
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精氨酸具备较强碱性，溶解和调pH过程会消耗大量盐酸；该专利技术使用的精氨酸脱亚胺酶菌体未进行固定化，容易引入各种杂质，且菌体基本无法套用。
[0005]专利CN105177075A首先对L
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精氨酸陶瓷膜过滤液进行树脂纯化，得到精氨酸树脂纯化液，但该过程使用树脂会产生大量高盐废水，且精氨酸树脂纯化液由于pH较高，在进行转化前还需要进行驱氨、调酸等处理，操作繁琐且需要消耗一定量酸。
[0006]综上，本领域亟需一种快速、高效、低成本制备高纯度L
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瓜氨酸的方法。

技术实现思路

[0007]为了解决现有技术中酶转化法生产L
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瓜氨酸过程中存在的杂质引入多、提纯困难、工艺复杂、酸耗量大和废水产生量大的问题，本专利技术提供了一种制备L
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瓜氨酸的方法。L
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精氨酸的提取过程中，不可避免的会出现收率损失。本专利技术只是对L
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精氨酸发酵液进行简单的陶滤、超滤处理，使其具备转化L
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瓜氨酸条件，不涉及树脂、电渗析等复杂提取操作，整体收率高于其它现有L
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精氨酸提取工艺。
[0008]使用本法生产L
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瓜氨酸省去了L
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精氨酸提取、纯化过程，在减少投入的同时缩短了生产周期，提高了生产效率。同时本专利技术使用的精氨酸脱亚胺酶固定在环氧树脂上，不仅可循环使用，还不会引入新的杂质，利于L
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瓜氨酸提纯。
glutamicum)，其保藏号为CCTCC NO:M 2020644。该菌种产生杂质少，便于后期提纯及转化。
[0027]在一些实施方案中，所述发酵培养的培养基包含葡萄糖60g/L、磷酸氢二钾2.5g/L，尿素1g/L，硫酸铵30g/L，酵母膏10g/L，玉米浆33g/L，硫酸镁1g/L、生物素0.2mg/L，糖蜜10g/L，硫酸锰3g/L；和/或，
[0028]所述发酵培养的培养条件包括：发酵温度30
±
1℃，罐压0.04～0.06Mpa，pH为6.8～7.0，溶氧控制为30％～40％。本专利技术中，pH可以通过氨水来控制。
[0029]在一些优选实施方案中，在所述发酵培养前还包括对所述谷氨酸棒杆菌进行种子培养以获得种子液的步骤，其中，所述种子培养所使用的种子培养基包括：葡萄糖30g/L、磷酸氢二钾2g/L、尿素1.2g/L、硫酸铵5g/L、酵母膏5g/L、玉米浆1g/L、硫酸镁0.4g/L、生物素0.2mg/L；和/或，
[0030]种子培养的条件包括：在往复式摇床式培养箱中培养，冲程80mm，85
±
5rpm，30.0
±
0.5℃，培养12～24h；
[0031]在一些优选实施方案中，所述发酵培养还包括按5％～20％例如15％的接种量将所述种子液接种至发酵培养的培养基中。
[0032]在一些实施方案中，所述精氨酸脱亚胺固定化酶的精氨酸脱亚胺酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，优选编码其的核酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0033]在一些优选实施方案中，所述精氨酸脱亚胺固定化酶由以下一种或多种方法制备：将树脂与所述精氨酸脱亚胺酶按照120mg蛋白/g树脂的比例投加，温度为20～23℃，低速搅拌15～25赫兹，周期40小时。
[0034]在一些更优选实施方案中，所述精氨酸脱亚胺酶的制备方法还包含以下一种或多种：
[0035](1)用于表达精氨酸脱亚胺酶的表达载体为pET21α表达载体；
[0036](2)用于表达精氨酸脱亚胺酶的基因工程菌为大肠杆菌BL21；
[0037](3)发酵培养基包含发酵培养基：酵母抽提物l0 g/L、氯化钠2g/L、氯化铵l g/L、磷酸氢二钾0.5g/L，磷酸二氢钾0.5g/L、七水硫酸镁0.5g/L、pH为7.0；
[0038](4)发酵条件包含37℃，200rpm，加入终浓度l mM的IPTG诱导，33℃，200rpm条件下诱导12h。
[0039]为解决上述问题，本专利技术第二方面提供了一种试剂盒，其包括谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)，所述谷氨酸棒杆菌的保藏号为：CCTCCNO:M 2020644，优选所述试剂盒还包括精氨酸脱亚胺固定化酶，所述精氨酸脱亚胺固定化酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0040]为解决上述问题，本专利技术第三方面提供了如本专利技术第二方面所述的试剂盒在制备L
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瓜氨酸中的应用。
[0041]在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本专利技术各较佳实例。
[0042]本专利技术所用试剂和原料均市售可得。
[0043]本专利技术的积极进步效果在于：
[0044](1)本专利技术不需要使用精氨酸成品进行瓜氨酸转化，且精氨酸发酵液无需行进行树脂等复杂的提本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种制备L
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瓜氨酸的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)将L
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精氨酸发酵菌进行发酵培养获得L
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精氨酸发酵液，经纯化后得到脱色液；(2)将所述脱色液在精氨酸脱亚胺固定化酶的催化下得到转化液，经除酶后提取L
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瓜氨酸。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述纯化的方法为：步骤(1)中，将所述的发酵液依次进行陶瓷膜过滤、超滤膜除杂、浓缩和脱色，分别获得陶滤液、超滤液、浓缩液和脱色液；优选地，所述纯化的方法包括以下条件的一种或多种：(i)所述陶瓷膜过滤使用的陶瓷膜孔径为50nm，得到截留菌液和陶滤液；(ii)所述超滤膜除杂为将所述陶滤液1000～3000道尔顿超滤膜除杂，得到超滤液；(iii)所述浓缩为使用旋转蒸发器对所述超滤液进行浓缩，得到浓缩液，优选真空度为
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0.095～
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0.1MPa，浓缩温度≤50℃；(iv)所述脱色为向所述浓缩液加入活性炭，得到脱色液；优选加入3～6％活性炭，例如5％活性炭，升温至45℃，脱色30min，使用滤膜例如0.22μm滤膜将活性炭滤出，得到脱色液。3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述转化液的制备方法为：将所述脱色液调pH至6～7后，加入3～10％精氨酸脱亚胺固定化酶，转化例如在35～40℃转化得到转化液；优选地，所述转化液的制备方法包括以下条件的一种或多种：所述pH值为6，所述温度为37℃，所述精氨酸脱亚胺固定化酶的加入量为5％。4.如权利要求1～3任一项所述的方法，其特征在于，所述除酶包括以下步骤：过滤除酶，得到滤液。5.如权利要求1～4任一项所述的方法，其特征在于，所述提取包括以下步骤：将所述滤液进行浓缩、结晶、离心、淋洗再离心并干燥后获得L
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瓜氨...

【专利技术属性】
技术研发人员：冉丁，余伟，李哲，王小松，
申请(专利权)人：河北远大九孚生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：