【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程和生物转化的。具体地，本专利技术涉及一种用于生产多不饱和脂肪酸的重组表达载体、重组工程菌及其构建方法。
技术介绍
1、二十二碳六烯酸，即dha，是人体所必需的一种多不饱和脂肪酸，在鱼油中含量较多，分子式为c22h32o2，是一种含有22个碳原子和6个双键的直链脂肪酸。dha是大脑细胞膜的重要构成成分，可辅助脑细胞发育，抗击衰老，改善血液循环，降血脂。
2、微生物发酵生产dha的研究已经取得了一定进展，但还存在一些问题：如发酵生产的毛油dha含量较低，无法满足需求。使用分子蒸馏等技术可以将dha含量提高到70％以上，但是过程比较繁杂。目前，现有技术中利用δ4去饱和酶提高dha含量的相关报道列举如下：
3、2009年，美国纳幕尔杜邦公司获得编码具有δ4去饱和酶活性的多肽的新基因构建体，并将其在解脂耶氏酵母中表达，证明来源于小型绿藻属的cf_gymnastica ccmp1594经密码子最优化后在解脂耶氏酵母中表达合成δ4去饱和酶，该酶具有将底物(二十二碳五烯酸，即dpa)转化成dha的活性，转化效率为约16％。
4、2008年，福建师范大学通过将海洋破囊壶菌的δ4-脱饱和酶在酿酒酵母中表达，并添加外源脂肪酸c22:5底物，在重组酵母的总脂肪酸中出现了dha新产物，证明δ4-脱饱和酶基因在酿酒酵母中得到了表达。
5、2011年，郭兵等人从球等鞭金藻中克隆到δ4-脂肪酸去饱和酶基因，将其转化到毕赤酵母中，通过外源添加底物进行发酵培养后分析转化子的脂肪酸组成，结果表明δ
6、尽管如此，现有技术中还存在工业化生产的产物中dha含量低的问题，目前亟需一种能够用于生产多不饱和脂肪酸的重组工程菌，用以提高产物中的dha含量。
技术实现思路
1、针对现有技术存在的不足，本专利技术的专利技术人设计出了一种重组表达载体，并利用该重组表达载体构建了一种可用于生产多不饱和脂肪酸的重组工程菌，从而能够以裂殖壶菌发酵破壁产物为原料制备具有更高dha含量的产物。
2、一方面，本专利技术提供了一种重组表达载体，其包含δ4去饱和酶基因，并且所述δ4去饱和酶基因来自海洋破囊壶菌、球等鞭金藻、假微型海链藻或小型绿藻属中的一种或多种，优选来自小型绿藻属。
3、根据本专利技术的一些实施方式，本专利技术所述的δ4去饱和酶基因的核苷酸序列选自seq id no.1～4中的一种或多种，优选为seq id no.4。
4、根据本专利技术的一些实施方式，本专利技术所述的重组表达载体的起始载体选自pet32a质粒、pet28a质粒或pgex 2t质粒中的一种或多种。
5、另一方面，本专利技术提供了一种重组工程菌，其包含本专利技术所述的重组表达载体。
6、根据本专利技术的一些实施方式，本专利技术所述重组工程菌的宿主细胞选自大肠杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母或枯草芽孢杆中的一种或多种；优选为大肠杆菌或毕赤酵母菌；更优选地，所述宿主细胞为大肠杆菌bl21(de3)。
7、又一方面，本专利技术提供了一种多不饱和脂肪酸的制备方法，其包括采用本专利技术的重组工程菌对含有dpa的原料进行生物转化的步骤。
8、根据本专利技术的一些实施方式，本专利技术所述含有dpa的原料由裂殖壶菌发酵产物经酶解破壁得到；优选地，按所述原料的总重量计，所述原料含有5～20重量％，优选10.8～14重量％的dpa；进一步优选地，按所述原料的总重量计，所述原料含有53～56重量％，优选为55重量％的dha。
9、根据本专利技术的一些实施方式，本专利技术所述的裂殖壶菌发酵产物的制备方法包括以下步骤：将裂殖壶菌在发酵培养基中在20℃～26℃，优选21.5℃～22.5℃，更优选22℃的温度，和30～120rpm，优选50～100rpm，更优选90rpm的转速下发酵96～168小时，优选96～144小时，更优选120小时。
10、优选地，按重量份数计，所述发酵培养基包含葡萄糖60份、谷氨酸钠24～36份、酵母浸粉5.86～8.8份、硫酸镁3.2～4.8份、氯化钙0.16～0.24份、氯化钾0.54～0.8份、磷酸二氢钾1.34～2份、硫酸钠2.8～4.2份、硫酸铵0.66～1份、氯化钠1.34～2份、碳酸氢钠0.1～0.14份和豆油0.08～0.12份。
11、更优选地，按重量份数计，所述发酵培养基包含葡萄糖60份、谷氨酸钠30份、酵母浸粉7.33份、硫酸镁4.00份、氯化钙0.20份、氯化钾0.67份、磷酸二氢钾1.67份、硫酸钠3.50份、硫酸铵0.83份、氯化钠1.67份、碳酸氢钠0.12份和豆油0.1份。
12、优选地，所述发酵的压力为0.04～0.06mpa，优选为0.05～0.06mpa，更优选为0.05mpa。
13、优选地，所述发酵的通风比为0.5～1，优选为0.5～0.7，更优选为0.6。
14、优选地，在发酵的0～48小时，残糖量控制为30～50g/l，在发酵的49～96小时，残糖量控制为10～30g/l，在发酵的97小时以后，残糖量控制为10g/l以下，在放罐之前4小时停止补糖。
15、根据本专利技术的一些实施方式，本专利技术所述的酶解破壁包括将裂殖壶菌菌体升温灭活，在碱性条件下采用碱性蛋白酶进行酶解破壁。
16、根据本专利技术的一些实施方式，本专利技术所述的多不饱和脂肪酸的制备方法包括将本专利技术所述的重组工程菌接种至酶发酵培养基中培养，加入诱导剂诱导培养，将获得的菌体经超声破壁获得包含δ4去饱和酶的溶液；以及将所述包含δ4去饱和酶的溶液加至含有dpa的原料进行生物转化。
17、根据本专利技术的一些实施方式，本专利技术所述的多不饱和脂肪酸的制备方法包括将本专利技术所述的重组工程菌接种至酶发酵培养基中在34～37℃，优选36～37℃，更优选为37℃的温度，和200～1000rpm，优选200～800rpm的转速下培养6～9小时，优选7～8小时，降温至20～26℃，优选22～25℃，加入诱导剂诱导培养12～18小时，优选14～16小时，更优选16小时，将离心获得的菌体经超声破壁获得包含δ4去饱和酶的溶液；以及将所述包含δ4去饱和酶的溶液加至含有dpa的原料在20～28℃，优选22～26℃，更优选22℃的温度下进行生物转化24～60小时，优选36～48小时，更优选48小时。
18、优选地，按重量份数计，所述酶发酵培养基包含葡萄糖10份、胰蛋白胨8～12份、酵母提取物4～6份和氯化钠8～12份。
19、更优选地，按重量份数计，所述酶发酵培养基包含葡萄糖10份、胰蛋白胨10份、酵母提取物5份和氯化钠10份。
20、优选地，所述培养的ph为7.0。
21、优选地，所述培养的通气量为0.5～2.5vvm，优选为1.0～2.0vvm。
22、优选地，所述包含δ4去饱和酶的溶液与含有dpa的原料的本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种重组表达载体，其包含Δ4去饱和酶基因，并且所述Δ4去饱和酶基因来自海洋破囊壶菌、球等鞭金藻、假微型海链藻或小型绿藻属中的一种或多种，优选来自小型绿藻属。
2.根据权利要求1所述的重组表达载体，其中所述Δ4去饱和酶基因的核苷酸序列选自SEQ ID NO.1～4中的一种或多种，优选为SEQ ID NO.4。
3.根据权利要求1或2所述的重组表达载体，其中所述重组表达载体的起始载体选自pET32a质粒、pET28a质粒或pGEX 2T质粒中的一种或多种。
4.一种重组工程菌，其包含根据权利要求1至3中任一项所述的重组表达载体。
5.根据权利要求4所述的重组工程菌，其中所述重组工程菌的宿主细胞选自大肠杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母或枯草芽孢杆中的一种或多种；优选为大肠杆菌或毕赤酵母菌；更优选地，所述宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)。
6.一种多不饱和脂肪酸的制备方法，其包括采用根据权利要求4或5所述的重组工程菌对含有DPA的原料进行生物转化的步骤。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其中所述含有DPA的原料由裂
8.根据权利要求7所述的制备方法，其中所述裂殖壶菌发酵产物的制备方法包括以下步骤：将裂殖壶菌在发酵培养基中在20℃～26℃，优选21.5℃～22.5℃，更优选22℃的温度，和30～120rpm，优选50～100rpm，更优选90rpm的转速下发酵96～168小时，优选96～144小时，更优选120小时；
9.根据权利要求6至8中任一项所述的制备方法，其包括将所述重组工程菌接种至酶发酵培养基中培养，加入诱导剂诱导培养，将获得的菌体经超声破壁获得包含Δ4去饱和酶的溶液；以及将所述包含Δ4去饱和酶的溶液加至含有DPA的原料进行生物转化；
10.根据权利要求6至9中任一项所述的制备方法，其包括以下步骤：
...【技术特征摘要】
1.一种重组表达载体，其包含δ4去饱和酶基因，并且所述δ4去饱和酶基因来自海洋破囊壶菌、球等鞭金藻、假微型海链藻或小型绿藻属中的一种或多种，优选来自小型绿藻属。
2.根据权利要求1所述的重组表达载体，其中所述δ4去饱和酶基因的核苷酸序列选自seq id no.1～4中的一种或多种，优选为seq id no.4。
3.根据权利要求1或2所述的重组表达载体，其中所述重组表达载体的起始载体选自pet32a质粒、pet28a质粒或pgex 2t质粒中的一种或多种。
4.一种重组工程菌，其包含根据权利要求1至3中任一项所述的重组表达载体。
5.根据权利要求4所述的重组工程菌，其中所述重组工程菌的宿主细胞选自大肠杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母或枯草芽孢杆中的一种或多种；优选为大肠杆菌或毕赤酵母菌；更优选地，所述宿主细胞为大肠杆菌bl21(de3)。
6.一种多不饱和脂肪酸的制备方法，其包括采用根据权利要求4或5所述的重组工程...
【专利技术属性】
技术研发人员：申术霞，田宁，王小松，余伟，
申请(专利权)人：河北远大九孚生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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