一种可溶性重组登革2型病毒制造技术

本发明专利技术公开了一种可溶性重组登革2型病毒

【技术实现步骤摘要】
一种可溶性重组登革2型病毒EDⅢ蛋白及其制备方法与应用


[0001]本专利技术涉及基因工程
，具体涉及一种可溶性重组登革2型病毒
E
蛋白结构域
IⅡ，本专利技术还涉及该可溶性重组登革2型病毒
E
蛋白结构域Ⅲ的制备方法及应用
。

技术介绍

[0002]登革热是目前流行最广泛，危害最为严重的一种虫媒传染病，是由登革病毒
(DENV)
感染引起的急性传染病
。
登革病毒属于黄病毒科黄病毒属，主要载体和传播媒介是白纹伊蚊和埃及伊蚊，其主要分为登革1～4四个血清亚型
(DENV1
，
DENV2
，
DENV3
和
DENV4)
，其中2型传播最为广泛
。
登革热早期主要流行于热带亚热带地区，随着全球气候变暖，城市化进程加剧以及国际人口流动频率增长，登革热的传播和流行进一步加剧，已经扩张到非热带地区
。
由于登革热传播迅速，发病率高，人群普遍易感和其高致命性，登革热已经成为一种严重的公共卫生问题
。
它给政府和个人都带来了沉重的经济负担
。
登革热已被我国列为重点防控的传染病之一
。
登革热病程发展快，可以在几天内从轻微发展到严重，诊断登革热感染的最佳窗口通常是从发烧开始到感染后
10
天，因此，研发快速准确的诊断工具以进行有效合理的疾病管理至关重要
。E
蛋白结构域
III(EDIII
蛋白
)
被证实为登革病毒的受体识别和结合区域，具有高度的免疫原性，被认为是理想的血清诊断靶标
。
[0003]从现有技术中公开的登革病毒血清学诊断方面的资料而言，主要存在以下方面的问题：
(1)
登革病毒有4种不同的血清型，交叉保护期后再次感染不同亚型的登革病毒会诱发抗体依赖的病毒感染增强效应，二次异型感染会诱发患者出现严重的登革出血热
(DHF)
和登革休克综合征
(DSS)。
但目前市场上仍缺乏有效的疫苗和特效的药物，登革病毒血清分型的即时检测试剂盒的研发具有重要意义和市场前景
。(2)EDIII
蛋白被证实为登革病毒的受体识别和结合区域，具有高度的免疫原性，被认为是理想的血清诊断靶标
。
但目前现有的重组
EDIII
蛋白制备方法所制备的重组蛋白均以无活性的不可溶的包涵体形式存在，想要获得具有生物活性的
EDIII
蛋白需将包涵体溶解变性后进行复性，大大增加了获得高活性
EDIII
重组蛋白的难度和成本，使得后续免疫学诊断和鉴别诊断十分困难
。

技术实现思路

[0004]为克服现有技术的不足，本专利技术的第一个目的是提供一种可溶性重组登革2型病毒
EDIII
蛋白，该蛋白以可溶性形式高效表达，使融合蛋白具有完全生物学活性，具有特异性强，亲和力高的优点
。
[0005]本专利技术的第二个目的是提供一种可溶性重组登革2型病毒
EDIII
蛋白的制备方法，该制备方法简单，后续操作简单
。
[0006]本专利技术的另一个目的在于提供一种该可溶性重组登革2型病毒
EDIII
蛋白作为检测登革2型病毒抗体的重组抗原蛋白的应用
。
[0007]一种可溶性重组登革2型病毒
EDIII
蛋白的制备方法，依次包括下述步骤：
[0008](1)
筛选检测登革2型病毒
EDIII
蛋白病毒高特异性编码基因片段，所述的氨基酸
序列如
SEQ ID NO.1
所示，所述的编码基因片段如
SEQ ID NO.2
所示；
[0009](2)
对登革2型病毒
EDIII
蛋白病毒高特异性编码基因片段将其进行密码子优化，优化后的序列如
SEQ ID NO.3
所示；
[0010](3)
设计
PCR
扩增引物，并通过
PCR
扩增编码基因；
[0011](4)
构建目的蛋白表达载体：通过将
EDIII
蛋白编码目的基因序列插入表达载体冷休克表达载体上，构建获得目的
EDIII
‑
pCold
‑
TF
蛋白表达载体；
[0012](5)
将步骤
(4)
中所得的
EDIII
‑
pCold
‑
TF
蛋白表达载体转化至宿主细胞大肠杆菌中，培养所述表达宿主细胞使其产生重组抗原蛋白，并通过蛋白纯化得到所述检测登革2型病毒抗体的可溶性重组抗原蛋白
。
[0013]进一步的，上述的可溶性重组登革2型
EDIII
蛋白的制备方法，所述的
CR
扩增引物为：
[0014]上游引物
pCold
‑
TF
‑
F1
：5’‑
CCACTTTCAACGAGCTGATG(SEQ ID NO.4)
；
[0015]PCold
‑
TF
‑
F1
：3’‑
GCGAAAGTGACTGAAAAAG(SEQ ID NO.5)
；
[0016]下游引物
pCold
‑
TF
‑
R
：5’‑
GGCAGGGATCTTAGATTCTG(SEQ ID NO.6)。
[0017]进一步的，上述的可溶性重组登革2型病毒
EDIII
蛋白的制备方法，所述的克隆位点为
NdeI
和
XhoI。
[0018]进一步的，上述的可溶性重组登革2型病毒
EDIII
蛋白的制备方法，在步骤
(4)
中所述的载体为
pCold
‑
TF
冷休克表达载体
。
[0019]进一步的，上述的可溶性重组登革2型病毒
EDIII
蛋白的制备方法，在步骤
(5)
中所述的载体为宿主细胞为
BL21
或
Rosetta
系列工程菌
。
[0020]进一步的，上述的可溶性重组登革2型病毒
EDIII
蛋白的制备方法，所述目的蛋白表达条件为以
IPTG
作为诱导物对工程菌进行诱导表达，诱导终浓度为
0.01
‑
1mM
，诱导温度为
15℃
‑
20℃
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种可溶性重组登革2型病毒
EDIII
蛋白的制备方法，其特征在于，依次包括下述步骤：
(1)
筛选检测登革2型病毒
EDIII
蛋白病毒高特异性编码基因片段，所述的氨基酸序列如
SEQ ID NO.1
所示，所述的编码基因片段如
SEQ ID NO.2
所示；
(2)
对登革2型病毒
EDIII
蛋白病毒高特异性编码基因片段将其进行密码子优化，优化后的序列如
SEQ ID NO.3
所示；
(3)
设计
PCR
扩增引物，并通过
PCR
扩增编码基因；
(4)
构建目的蛋白表达载体：通过表达载体上的多克隆位点将
EDIII
蛋白编码目的基因序列插入表达载体冷休克表达载体上，构建获得目的
EDIII
‑
pCold
‑
TF
蛋白表达载体；
(5)
将步骤
(4)
中所得的
EDIII
‑
pCold
‑
TF
蛋白表达载体转化至宿主细胞大肠杆菌中，培养所述表达宿主细胞使其产生重组蛋白，并通过蛋白纯化得到所述检测登革2型病毒抗体的可溶性重组抗原蛋白
。2.
根据权利要求1所述的可溶性重组登革2型病毒
EDIII
蛋白的制备方法，其特征在于，所述的
CR
扩增引物为：上游引物
pCold
‑
TF
‑
F1
：5’‑
CCACTTTCAACGAGCTGATG(SEQ ID NO.4)
；
PCold
‑
TF
‑
F 1
：3’‑
GCGAAAGTGACTGAAAAAG(SEQ ID NO.5)
；下游引物
pCold
‑
TF
‑
R
：5’‑
GGCAGGGATCTTAGATTCTG(SEQ ID NO.6)。3.
根据权利要求1所述的可溶性重组登革2型病毒
EDIII
蛋白的制备方法，其特征在于，所述的克隆位点为
NdeI
和
Xh...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵肃清，马梓婷，郭锦年，蒋璐，苏静怡，韩泽林，
申请(专利权)人：广东工业大学，
类型：发明
国别省市：