亚硝胺类化合物致突变性评价方法及应用技术

本发明专利技术涉及一种亚硝胺类化合物致突变性评价方法及应用，属于化合物致突变性评价技术领域。该方法包括以下步骤：菌株扩增：取鼠伤寒沙门氏菌组氨酸营养缺陷型菌株，加入培养基中培养扩增，得到测试菌液；回复突变试验：以待评估亚硝胺类化合物为受试物，按照预定剂量配制为受试物溶液，建立液态非代谢活化培养体系和液态代谢活化培养体系进行试验；致突变性评价：向上述非代谢活化培养体系和代谢活化培养体系中加入溴麝香草酚蓝，对培养体系的显色情况进行分析，得到待评估亚硝胺类化合物的致突变性评价结果。该方法选择液态试验体系促进受试物与菌株充分接触以及在液态培养体系中充分代谢活化，从而提高评价结果的灵敏度并减少受试物使用量。受试物使用量。

【技术实现步骤摘要】
亚硝胺类化合物致突变性评价方法及应用


[0001]本专利技术涉及化合物致突变性评价
，特别是涉及一种亚硝胺类化合物致突变性评价方法及应用。

技术介绍

[0002]药品在生产合成和贮运过程中可能引入对人体有害的杂质，其中遗传毒性杂质为一类具有潜在致癌风险的杂质，长期服用含遗传毒性杂质的药物可导致肿瘤的发生。
[0003]亚硝胺类化合物由亚硝酸盐或氮氧化物等与胺类物质反应后生成，该反应可存在于药品生产中的各个环节，来自原料药的生产试剂、降解产物、包装材料等。近年来，多种药品中可发现N
‑
亚硝基二甲胺(N
‑
nitrosodimethylamine，NDMA)，作为药品杂质其遗传毒性风险以及监管限度的确定受到广泛关注。除NDMA外，已知亚硝胺类化合物有120余种。国际癌症研究机构(international agency for research on cancer，IARC)将亚硝胺类化合物列为2A类致癌物，已有动物致癌数据，且机制研究提示其存在致癌风险。在监管方面，参考人用药品注册技术要求国际协调会(ICH，International council for harmonization of technical requirement for pharmaceuticals for human use)在2017年发布的M7指导原则(ICH M7:Genotoxic Impurities
‑
Assessment and Control of DNA Reactive(Mutagenic)in Pharmaceuticals to Limit Potential Carcinogenic Risk,简称ICH M7)，亚硝胺类化合物属于较高致癌风险的“关注队列”(cohort of concern，COC)。根据NDMA和NMBA对大鼠的50％致癌剂量(median toxic dose，TD50)值折算，成人每日最大摄入量不超过96ng；NDEA、NDBA、NDIPA和NEIPA则为26.5ng。
[0004]然而，并非所有亚硝胺类化合物均存在致突变性。随着对药品中亚硝胺类杂质控制的重视，明确某个亚硝胺类化合物是否具有致突变性是界定其监管限度的关键。尽管有预测软件可以早期筛选出含警示结构的杂质，但软件预测结果受软件所用数据库的信息储备及计算方法的影响，其预测结果有限。文献报道，2005年至2011年间，ICH M7推荐使用的毒理学数据库Derek Nexus对化合物的预测灵敏度仅为50％，提示存在致突变风险的化合物可能在软件预测中得到假阴性结果。因此开展试验研究对杂质毒性评价具有重要价值。
[0005]细菌回复突变试验(bacterial reverse mutation test，即Ames试验)是最常用的评价化合物是否具有基因突变风险的方法。该试验利用缺乏合成组氨酸能力的细菌，在不含组氨酸的选择性培养基中仅形成显微镜下可见的微菌落，而在诱变剂作用下可发生回复突变并通过自行合成组氨酸来形成肉眼可见的菌落的原理而建立，已成为国际公认的化学诱变剂常规检测的首选初筛试验。Ames试验是当前所有遗传毒性评价方法中对致癌物预测度最高的试验，大鼠致癌试验和恒河猴试验中检出的致癌物，在Ames试验中的检出率分别为69.0％和87.5％，也是化合物QSAR构效关系建立的遗传毒性筛选数据库的重要基础。
[0006]然而，亚硝胺类化合物的致突变性主要与其代谢产物有关，其中CYP2E1为主要代谢酶。大鼠肝微粒体S9是最常用的Ames试验的代谢活化系统，但基于传统Ames试验对于亚硝胺类化合物的代谢能力不佳，有可能无法检出其致突变性。
[0007]此外，杂质的形成多与原料药成分、合成路径或分解路径有关，一个药物中可能含有10～20种含类似基团的杂质。传统细菌回复突变试验方法使用受试物量约1g，杂质的化学合成成本较高。同时，由于试验工作量较大，且试剂和耗材的成本均较高。如需使用5个菌株，制备约200个平皿等，不适宜对大量杂质进行筛选。再考虑到部分亚硝胺类杂质的体内致突变性/致癌性风险来自其代谢产物，而传统的细菌回复突变试验体外代谢活化条件不够充分，可能导致假阴性结果。同时由于传统Ames试验需人工肉眼观察结果，从而使得菌落计数结果存在不够客观的问题。
[0008]因而，基于传统方法的亚硝胺类化合物的杂质类成分致突变性试验筛选费时费力且成本高，难以展开高通量式筛选评估。

技术实现思路

[0009]基于此，有必要针对上述传统Ames试验方法(平皿法)对亚硝胺类化合物致突变性试验筛选费时费力且成本高的问题，提供一种亚硝胺类化合物致突变性评价方法，不仅具有快速低成本的特点，还可提高评价结果的灵敏度并减少受试物使用量，在实现高通量的同时，还能兼具客观的优势。
[0010]一种亚硝胺类化合物致突变性评价方法，包括以下步骤：
[0011]菌株扩增：取鼠伤寒沙门氏菌组氨酸营养缺陷型菌株，加入培养基中培养扩增，得到测试菌液；
[0012]回复突变试验：以待评估亚硝胺类化合物为受试物，按照预定剂量配制为受试物溶液，建立液态非代谢活化培养体系和液态代谢活化培养体系进行试验，其中，非代谢活化试验方法为：取液态非代谢活化选择性生长培养基，加入所述测试菌液和受试物溶液得到测试组，同时设置阴性对照物组，在多孔板中进行细胞培养；代谢活化试验方法为：取液态代谢活化选择性生长培养基，加入所述测试菌液和受试物溶液得到测试组，同时设置阴性对照物组，在多孔板中进行细胞预培养，预培养预定时间后，再加入液态代谢活化选择性培养基，继续培养；
[0013]致突变性评价：向上述非代谢活化培养体系和代谢活化培养体系中加入指示剂，对培养体系的显色情况进行分析，得到待评估亚硝胺类化合物的致突变性评价结果。
[0014]专利技术人在前期实践工作中发现，常规Ames试验容易导致假阴性结果，可能是由于固态平皿试验使得体外代谢活化条件不够充分而导致。且平皿试验对于化合物用量较大，操作复杂，难以进行高通量筛选。
[0015]在此基础上，本专利技术人提出上述亚硝胺类化合物致突变性评价方法，以多孔板(如96板等)代替标准平皿，选择液态试验体系促进受试物与菌株充分接触，并在液态培养体系中充分代谢活化，从而提高评价结果的灵敏度并减少受试物使用量。
[0016]在其中一个实施例中，所述指示剂为溴麝香草酚蓝；
[0017]所述鼠伤寒沙门氏菌组氨酸营养缺陷型菌株为数量比为6
‑
10:1的TA98和TA100混合菌株；优选数量比为7
‑
9:1的TA98和TA100混合菌株，更优选9:1。
[0018]所述菌株扩增步骤中，扩增培养至菌液中菌株密度不低于5
×
108个/mL
‑5×
109个/mL(OD
600
值约为0.4
‑
0.6)，按照1mL菌液：9
±
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种亚硝胺类化合物致突变性评价方法，其特征在于，包括以下步骤：菌株扩增：取鼠伤寒沙门氏菌组氨酸营养缺陷型菌株，加入培养基中培养扩增，得到测试菌液；回复突变试验：以待评估亚硝胺类化合物为受试物，按照预定剂量配制为受试物溶液，建立液态非代谢活化培养体系和液态代谢活化培养体系进行试验，其中，非代谢活化试验方法为：取液态非代谢活化选择性生长培养基，加入所述测试菌液和受试物溶液得到测试组，同时设置阴性对照物组，在多孔板中进行细胞培养；代谢活化试验方法为：取液态代谢活化选择性生长培养基，加入所述测试菌液和受试物溶液得到测试组，同时设置阴性对照物组，在多孔板中进行细胞预培养，预培养预定时间后，再加入液态代谢活化选择性培养基，继续培养；致突变性评价：向上述非代谢活化培养体系和代谢活化培养体系中加入指示剂，对培养体系的显色情况进行分析，得到待评估亚硝胺类化合物的致突变性评价结果。2.根据权利要求1所述的亚硝胺类化合物致突变性评价方法，其特征在于，所述指示剂为溴麝香草酚蓝；所述鼠伤寒沙门氏菌组氨酸营养缺陷型菌株为数量比为6
‑
10:1的TA98和TA100混合菌株；所述菌株扩增步骤中，扩增培养至菌液中菌株密度为5
×
108个/mL
‑5×
109个/mL，按照1mL菌液：9
±
2mL 0.1M PBS溶液的量加入PBS溶液，调pH至7.4，包裹避光，在37℃条件下继续培养3h，即得测试菌液，所述测试菌液菌株密度不低于1
×
109个/mL；所述液态非代谢活化选择性生长培养基包含以下比例的成分：D
‑
M half盐溶液200mL,20
±
2％的葡萄糖溶液2mL,0.1
±
0.01％的组氨酸1mL和0.1
±
0.01％的生物素0.04mL；所述液态代谢活化选择性生长培养基包含以下比例的成分：0.1
±
0.01M pH7.4的PBS液60mL,20
±
2％的葡萄糖溶液0.8mL,S9混合液20
±
2mL,0.1
±
0.01％的组氨酸0.02mL和0.1
±
0.01％的生物素0.8mL；所述S9混合液包含以下体积比的成分：33.5％的灭菌注射用水，50％的0.2
±
0.2M PNa buffer(pH 7.4),4％的0.1
±
0.01M NADP Na2,0.5％的1
±
0.1M G
‑6‑
P Na2，2％的1.65
±
0.16MKCl、0.4
±
0.04M MgCl2和10％的大鼠肝微粒体S9；所述液态代谢活化选择性培养基包含以下体积比的成分：D
‑
M half盐溶液200mL,20
±
2％葡萄糖溶液8mL。3.根据权利要求1所述的亚硝胺类化合物致突变性评价方法，其特征在于，受试物的预定剂量通过以下方法得到：配置若干浓度的受试物溶液，加入至毒性试验选择性生长培养基中，进行细胞培养后观察培养体系颜色和/或细胞生长情况，以细胞生长不受抑制的最大剂量为预定剂量上限。4.根据权利要求3所述的亚硝胺类化合物致突变性评价方法，其特征在于，所述毒性试验选择性生长培养基包含以下比例的成分：D
‑
M full盐溶液100mL,20
±
2％的葡...

【专利技术属性】
技术研发人员：文海若，耿兴超，汪祺，杨颖，叶倩，王亚楠，胡燕平，王三龙，
申请(专利权)人：中国食品药品检定研究院，
类型：发明
国别省市：