基于肝类器官芯片的缓解非酒精性脂肪肝活性成分筛选方法及其应用技术

本发明专利技术提供了一种基于肝类器官芯片的缓解非酒精性脂肪肝活性成分筛选方法及其应用

【技术实现步骤摘要】
基于肝类器官芯片的缓解非酒精性脂肪肝活性成分筛选方法及其应用


[0001]本专利技术涉及组织工程和生物医学领域，具体涉及一种基于肝类器官芯片的缓解非酒精性脂肪肝活性成分筛选方法及其应用
。

技术介绍

[0002]肝脏是重要而复杂的器官，参与蛋白质及脂肪代谢
、
胆汁制造
、
解毒
、
免疫调节等功能
。
非酒精性脂肪性肝是常见的肝脏代谢综合征，与肥胖
、
胰岛素抵抗
、
高血压等危险因素密切相关
。
该病以脂肪变性为特征，发展为肝炎
、
肝硬化甚至癌症
。
病程通常伴有多种病理事件，包括炎症细胞浸润
、
纤维化
、
代谢失调和门脉高压等
。
肝脏体外模型对疾病研究（如疾病发生及治疗机制的剖析）和药效评价极其重要
。
人参皂苷作为人参的主要成分，具有降脂
、
降糖
、
抗癌等多种生物活性
。
由于结构的多样性（
>150 种），不同结构的人参皂苷表现出了显著的活性差异
。
对这些人参皂苷的活性成分进行快速检测和筛选，阐明其对机体健康的影响具有重要意义
。
当前，体外人参皂苷活性评价主要集中于动物实验和
2D
单层细胞实验
。
由于种属差异，动物模型不能充分代表人类的生物学特征
。2D
单层细胞实验大都采用静态培养的方式，缺乏对体内环境的动态再现，很难模拟器官功能的关键特征，药物活性预测能力较差
。
[0003]类器官芯片技术是近几年提出的新兴技术，即将干细胞
、
类器官与器官芯片相集成，以微型化
、
高保真等优势为体外模拟人体用药提供了全新的平台
。
它是结合干细胞发育学和工程学原理，利用成体或多潜能干细胞在芯片上自组装的特性，在生物流体作用下，产生具有近生理功能的类器官
。
干细胞可充分利用器官芯片的微结构原位组装并诱导分化，形成
3D
肝类器官，微流控技术可赋予更为仿生的器官发育环境，包括流体剪切力
、
信息交互
、
药物梯度等
。
目前，国际范围内虽已建立肝
、
脑
、
肠
、
肺等
3D
类器官，强调了该工程技术在生物医学与精准医学领域的重要性和发展潜力
。
将干细胞
、
类器官芯片和微流体相结合可以最大程度地体外重塑器官生理及病理特征，反映机体地药物响应，弥补动物模型和单层细胞培养在人参皂苷活性筛选与评价方面的不足，同时解决现有单一技术在体外器官重塑和药物评价的局限
。
且该集成技术用于人参皂苷生物活性高通量筛选尚属空白，有望为解析非酒精性脂肪肝病理机制及筛选具有缓解该病的人参皂苷成分提供全新的技术手段
。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是提供一种基于肝类器官芯片的缓解非酒精性脂肪肝活性成分筛选方法及其应用
。
该技术方案有效地实现了
3D
肝类器官病理模拟和人参皂苷生物活性评价
。
该动态灌流体系重塑了体内复杂的细胞组分
、
生理流体
、3D
组织形态等关键微环境要素，不仅实现了体外病理肝脏模型构筑，同时具备药物如人参皂苷高通量筛选的潜力，再现人体肝脏对不同药物如人参皂苷梯度的药物响应
。
该平台有望为体外器官再造
、
药物功效筛选及机体对药物的响应机制探提供全新的研究平台与技术支撑
。
该方法不限于人参皂苷
类成分的通量筛选，可拓展于其它成型药物或先导药物评价
。
[0005]本专利技术提供了一种基于肝类器官芯片的缓解非酒精性脂肪肝药物活性成分筛选方法，其步骤如下：第一步，在高通量类器官芯片中形成
3D
非酒精性脂肪肝类器官；第二步，进行药物生物活性筛选，其是用药物干预所述
3D
非酒精性脂肪肝类器官
。
[0006]所述类器官芯片主要由数个微阵列单元构成，其中每个阵列单元由细胞和培养基入口
、
灌流通道
、
微型阵列结构
、
培养基出口组成，细胞由细胞和培养基入口进入后滞留在微型阵列结构，原位组装并诱导形成类器官，培养基按照一定的流速由细胞和培养基入口进入后通过含微型阵列结构的灌流通道，再由培养基出口流出
。
阵列单元之间可以通过灌流管进行联通，也可以进行独立操控，芯片构建具有灵活
、
可控与高通量的特点
。
[0007]所述类器官芯片由上下层构成，材料为聚二甲基硅氧烷（
PDMS
）
。
阵列单元的个数为1‑8个，微型阵列结构可以是坑状或柱状，微坑
/
柱的直径范围为
200 μ
m
‑
1 mm
，深度范围为
200 μ
m
‑
800 μ
m
，间距范围为
50
‑
500 μ
m。
[0008]所述类器官芯片中培养基流速为 30
‑
100 μ
L/h。
[0009]所述高通量类器官芯片的搭建，具体步骤为：采用常规软光刻技术制备芯片，将形成的模板浇筑
PDMS
预聚体得到上下层，经过氧等离子处理
10
‑
90 s
后封接，接着用一定浓度的
PF127
疏水修饰芯片，备用
。
[0010]所述
PF127
修饰芯片的浓度范围为
0.1 %
‑
1 %
，作用时间为1‑
24 h。
[0011]本专利技术提供的
3D
非酒精性脂肪肝类器官的形成，具体步骤为：（1）人多潜能干细胞向肝特异性内胚层分化：培养基为
RPMI
‑
1640
培养基中添加一定浓度的
GlutaMAX、KSR、B27
和
ActivinA
，处理5天后更换为
RPMI
‑
1640
中含
GlutaMAX、KSR、B27、BMP4
和
bFGF
的培养基处理3天
。
[0012]所述
GlutaMAX、KSR
和
B27
范围均为
0.1
‑
5%
，
Activi本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种基于肝类器官芯片的缓解非酒精性脂肪肝药物活性成分的筛选方法，其特征在于：步骤如下：第一步，在高通量类器官芯片中形成
3D
非酒精性脂肪肝类器官；第二步，进行药物生物活性筛选，其是用药物干预所述
3D
非酒精性脂肪肝类器官；其中，所述高通量类器官芯片由一个或多个微阵列单元构成，其中每个阵列单元由细胞和培养基入口（1）
、
灌流通道（2）
、
微型阵列结构（3）
、
培养基出口（4）组成，细胞由细胞和培养基入口（1）进入后滞留在微型阵列结构，原位组装并诱导形成类器官，培养基按照一定的流速由细胞和培养基入口（1）进入后通过含微型阵列结构（3）的灌流通道，再由培养基出口（4）流出；阵列单元之间通过灌流管进行联通或者各单元之间独立操控；所述
3D
非酒精性脂肪肝类器官的形成的具体步骤为：
S1
人多潜能干细胞向肝特异性内胚层分化：培养基为
RPMI
‑
1640
培养基中添加
GlutaMAX、KSR、B27
和
ActivinA
，处理5天后更换为
RPMI
‑
1640
中含
GlutaMAX、KSR、B27、BMP4
和
bFGF
的培养基处理3天；
S2
向肝祖细胞分化：用
RPMI
‑
1640
培养基中添加
GlutaMAX、KSR、B27
和
HGF
的培养基处理4‑6天；
S3
肝细胞分化及类器官形成：用
HCM
培养基中添加
OSM
和
Dex
的培养基处理4‑6天；
S4
肝类器官长期培养：用
HCM
培养基中添加
Dex
的培养基进行长期培养；
S5
游离脂肪酸暴露：用
HCM
培养基中添加
Dex
和游离脂肪酸的培养基处理1‑7天
。2.
按照权利要求1所述的筛选方法，其特征在于：所述类器官芯片由上下层构成，材料为聚二甲基硅氧烷；阵列单元的个数为1‑8个，微型阵列结构（3）是坑状或柱状
。3.
按照权利要求2所述的筛选方法，其特征在于：所述微型阵列结构的直径范围为
200 μ
m
‑
1 mm
，深度范围为
200 μ
m
‑
800 μ
m
，间距范围为
50
‑
500 μ
m。4.
按照权利要求2所述的筛选方法，其特征在于：所述高通量类器官芯片的制作步骤为：采用软光刻技术制备芯片，将形成的模板浇筑
PDMS
预聚体得到上下层，经过氧等离子处理
10
‑
90 s
后封接，...

【专利技术属性】
技术研发人员：尤晓颜，王慧，赵国屏，布青云，李亚春，
申请(专利权)人：中国科学院天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：