一种酒体微量成分对细胞自噬通量影响的检测方法技术

本发明专利技术公开了一种酒体微量成分对细胞自噬通量影响的检测方法，涉及食品分析技术领域，该方法包括将自噬探针引入细胞内、设置处理组和对照组、使用流式细胞仪检测GFP和RFP信号、计算GFP/RFP信号比值以估计自噬通量、比较不同处理组之间的自噬通量差异并评估酒体微量成分对细胞自噬通量的影响。本发明专利技术检测方法简便、快速、客观、高通量，对于研究不同酒体微量成分物质对细胞自噬通量的影响具有重要的生物学意义和实际应用价值。生物学意义和实际应用价值。生物学意义和实际应用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种酒体微量成分对细胞自噬通量影响的检测方法


[0001]本专利技术涉及食品分析
，更具体的说是涉及一种酒体微量成分对细胞自噬通量影响的检测方法。

技术介绍

[0002]酒精饮料是供人们饮用的且乙醇含量在0.5％alc/vol以上的饮料，酒精饮料生产历史悠久，工艺传承久远，在漫长的发展历史中，产生了丰富的品种。酒体中含有丰富的微量成分，包括醇类、醛类、酮类、醚类、酸类、酯类、缩醛类、硫化物类、吡嗪类、吡啶类、呋喃类、酚类、芳香族类、内酯类化合物以及其他化合物，这些化合物中有很多对酒体的风味产生了重要的贡献。醇类是酒中的重要呈香呈味物质，它们不仅有增加酒的口感作用，也是酸、酯形成的前驱物质。酸、酯的种类及含量决定了酒的香型与风格，其含量的高低直接影响到酒质的好坏，是形成酒体风格典型性的关键物质。然而，这些微量成分对人体健康影响的研究尚不充分，这限制了我们对酒体风味与生物效应之间关联的深入了解。
[0003]细胞自噬是一种细胞内降解过程，通过该过程，细胞可以回收并重新利用细胞器和蛋白质等生物大分子。细胞自噬在生物体的生长、发育、免疫和疾病等过程中起到重要作用。因此，研究不同物质对细胞自噬通量的影响具有重要的生物学意义和实际应用价值。
[0004]目前，测量细胞自噬的方法主要有蛋白印迹法、免疫荧光显微镜法等，这些方法虽然可以定性或定量地测量细胞自噬，但存在操作繁琐、耗时较长、数据主观性较大等缺点。
[0005]因此，开发一种简便、快速、客观、高通量的酒体微量成分对细胞自噬通量的检测方法具有重要意义。

技术实现思路

[0006]有鉴于此，本专利技术提供了一种酒体微量成分对细胞自噬通量影响的检测方法。
[0007]为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0008]一种酒体微量成分对细胞自噬通量影响的检测方法，包括以下步骤：
[0009](1)通过慢病毒转染方法，将自噬探针GFP
‑
LC3
‑
RFP
‑
LC3ΔG引入细胞内，将细胞在含有对应抗生素的培养基中进行培养，再通过流式细胞仪进行单细胞分选，筛选出稳定的高表达自噬探针的细胞株；
[0010](2)通过设置营养组、饥饿处理组和饥饿处理加自噬抑制剂组，评估饥饿处理及自噬抑制剂对细胞自噬通量的影响；
[0011]所述自噬探针GFP
‑
LC3
‑
RFP
‑
LC3ΔG被内源性ATG4蛋白酶切割成等摩尔量的GFP
‑
LC3和RFP
‑
LC3ΔG，在细胞自噬过程中GFP
‑
LC3被降解，而RFP
‑
LC3ΔG被保留在细胞质中，流式细胞仪通过检测转染细胞中的GFP和RFP的信号，计算GFP/RFP信号比值，得细胞自噬通量；
[0012](3)将酒体微量成分与转染细胞共孵育，通过流式细胞仪获取的GFP/RFP信号比值，检测不同浓度酒体微量成分对细胞自噬通量的影响。
[0013]流式细胞仪是一种高通量细胞分析仪器，本专利技术通过搭配特异荧光探针GFP
‑
LC3
‑
RFP
‑
LC3ΔG(该探针只能被内源性ATG4蛋白酶切割成等摩尔量的GFP
‑
LC3和RFP
‑
LC3ΔG，不受其他细胞干扰，检测特异性高)，可以实现对细胞内细胞自噬过程的定量分析，本专利技术方法简便、快速、客观、高通量，对于研究不同酒体微量成分物质对细胞自噬通量的影响具有重要的生物学意义和实际应用价值。
[0014]作为优选的技术方案，步骤(1)慢病毒转染细胞的过程中，添加辅助感染剂；优选的，辅助感染剂为Polybrene。
[0015]作为优选的技术方案，步骤(2)饥饿处理培养基包括EBSS，自噬抑制剂包括BafA1。
[0016]作为优选的技术方案，所述细胞包括肝细胞。
[0017]作为优选的技术方案，所述酒体微量成分包括但不限于乳酸、乙酸、丙酸、甲酸、异丁酸、正丁酸、月桂酸、阿魏酸、丙酮酸异戊酸、2
‑
乙基丁酸、戊酸、氯离子、己酸、硝酸根、苹果酸、酒石酸、硫酸根、草酸、富马酸、磷酸、柠檬酸、正丙醇、正丁醇、异丁醇、仲丁醇、戊醇、异戊醇、β
‑
苯乙醇、有丙三醇、2，3
‑
丁二醇、赤藓醇、甘露醇、阿拉伯糖醇、乙醛、乙缩醛、1,1
‑
二乙氧基异丁烷、1,1
‑
二乙氧基异戊烷、丙醛、异丁醛、异戊醛、糠醛、丁二酮、己酮、2,3
‑
丁二酮、3
‑
羟基丁酮、乙酸乙酯、己酸乙酯、乳酸乙酯、丁酸乙酯、甲酸乙酯、乙酸异戊酯、异戊酸乙酯、丙酸乙酯、戊酸乙酯、庚酸乙酯、辛酸乙酯、壬酸乙酯、癸酸乙酯、丁二酸二乙酯、月桂酸乙酯、苯乙酸乙酯、棕榈酸乙酯、油酸乙酯、亚油酸乙酯、苯甲醛、β
‑
苯乙醇、苯甲酸乙酯、苯乙酸乙酯、苯酚、愈创苯酚、苯甲酸、香草酚、糠酸、有四甲基吡嗪、三甲基吡嗪、4
‑
甲基愈创木酚、4
‑
乙基愈创木酚、2,6
‑
二甲基吡嗪、谷氨酸、丙氨酸、门冬氨酸、酪氨酸、精氨酸、甘氨酸、a
‑
派烯。
[0018]更优选的，所述酒体微量成分的浓度范围为0ppm～4000ppm(不包括0ppm)。
[0019]作为优选的技术方案，酒体微量成分对细胞自噬通量影响的检测方法采用红绿双荧光探针GFP
‑
LC3
‑
RFP
‑
LC3ΔG，该探针可被内源性ATG4蛋白酶切割成等摩尔量的GFP
‑
LC3和RFP
‑
LC3ΔG，确保探针的切割和定位不受其他细胞干扰，且在细胞自噬过程中GFP
‑
LC3被降解，而RFP
‑
LC3ΔG被保留在细胞质中，以RFP荧光作为内参，计算GFP/RFP信号比值，得细胞自噬通量。
[0020]由于影响自噬的关键蛋白LC3蛋白为膜内蛋白，用普通带荧光的抗体对其进行检测必然涉及到细胞膜的固定、通透以及荧光抗体的跨膜，故标记效率将受到蛋白跨膜率的影响，导致结果不稳定。本专利技术采用红绿双荧光探针标记，并以红色荧光作为内参，通过红绿荧光的比值来确保信号稳定，且不受蛋白跨膜率的影响，使检测结果稳定性显著提升。
[0021]我们采用流式细胞分选仪对表达红绿荧光的细胞株进行了单细胞分选，得到了稳定插入基因组的高表达红绿荧光的细胞株。
[0022]本专利技术的另一目的是，提供上述的检测方法在如下(1)
‑
(4)至少一项中的应用：
[0023](1)评估酒体风味成分与生物效应之间的关系；
[0024](2)优化酿酒工艺流程，改良酒体风味；
[0025](3)涉及酒水的食品安全风险评估；...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种酒体微量成分对细胞自噬通量影响的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)通过慢病毒转染方法，将自噬探针GFP
‑
LC3
‑
RFP
‑
LC3ΔG引入细胞内，将细胞在含有对应抗生素的培养基中进行培养，再通过流式细胞仪进行单细胞分选，筛选出稳定的高表达自噬探针的细胞株；(2)通过设置营养组、饥饿处理组和饥饿处理加自噬抑制剂组，评估饥饿处理及自噬抑制剂对细胞自噬通量的影响；所述自噬探针GFP
‑
LC3
‑
RFP
‑
LC3ΔG被内源性ATG4蛋白酶切割成等摩尔量的GFP
‑
LC3和RFP
‑
LC3ΔG，在细胞自噬过程中GFP
‑
LC3被降解，而RFP
‑
LC3ΔG被保留在细胞质中，流式细胞仪通过检测转染细胞中的GFP和RFP的信号，计算GFP/RFP信号比值，得细胞自噬通量；(3)将酒体微量成分与转染细胞共孵育，通过流式细胞仪获取的GFP/RFP信号比值，检测不同浓度酒体微量成分对细胞自噬通量的影响。2.根据权利要求1所述的酒体微量成分对细胞自噬通量影响的检测方法，其特征在于，步骤(1)慢病毒转染细胞的过程中，添加辅助感染剂Polybrene。3.根据权利要求1所述的酒体微量成分对细胞自噬通量影响的检测方法，其特征在于，步骤(2)饥饿处理培养基包括EBSS，自噬抑制剂包括BafA1。4.根据权利要求1所述的酒体微量成分对细胞自噬通量影响的检测方法，其特征在于，所述细胞包括肝细胞。5.根据权利要求1所述的酒体微量成分对细胞自噬通量影响的检测方法，其特征在于，所述酒体微量成分包括但不限于乳酸、乙酸、丙酸、甲酸、异丁酸、正丁酸、月桂酸、阿魏酸、丙酮酸异戊酸、2
‑
乙基丁酸、戊酸、氯离子、己酸、硝酸根、苹果酸、酒石酸、硫酸根、草酸、富马酸、磷酸、柠檬酸、正丙醇、正丁醇、异丁醇、仲丁醇、戊醇、异戊醇、β
‑
苯乙醇、有丙三醇、2，3
‑
丁二醇、赤藓醇、甘露醇、阿拉伯糖醇、乙醛、乙缩醛、1,1
‑
二乙氧基异...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗蕊琪，钟恒，韩兴林，王德良，陈杉彬，
申请(专利权)人：中国食品发酵工业研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：