【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种用来鉴定产黄曲霉毒素菌株的引物及其应用，属于生物。
技术介绍
1、黄曲霉毒素主要是由黄曲霉( aspergillus flavus)、寄生曲霉( aspergillus parasiticus)等霉菌产生的一类化学结构类似的毒性代谢产物，广泛存在于土壤、粮食、坚果和多种加工食品中，具有致突变性、致畸性、致癌性和急性毒性，是公认的毒性最大的真菌毒素。它是目前发现的较强的致癌物质，主要诱发肝癌，严重威胁人类的身体健康，被世界卫生组织国际癌症研究机构列为1类致癌物质。因此，有效防控黄曲霉毒素污染，对于保障我国食品安全和公民身体健康具有重要意义。
2、研究表明，不同菌株产黄曲霉毒素能力存在明显差异，如何鉴定是否为产黄曲霉毒素菌株对于企业生产和产品的安全控制至关重要。目前，鉴定菌株是否产黄曲霉毒素主要有两种方法，其一是先对待测菌株培养，提取毒素，再通过液相、酶联免疫等方法开展毒素含量测定，具有检测周期长、工作量大等缺点；另一种方法是通过分子生物学方法检测菌株是否含有完整的黄曲霉毒素产毒基因，具有检测周期短、成本低等优点。如我国进出口行业标准方法《sn/t 2582-2010产黄曲霉毒素真菌pcr检测方法》公布了通过检测调控基因aflr、柄曲霉素转甲氧基omt-1和杂色曲霉素a脱氢酶 ver-1的有无来判断待检菌株是否具有产黄曲霉毒素的能力，但已有研究发现该方法存在假阳性风险。因此，开发一种快速精准鉴别产
3、本专利技术基于前期研究成果，通过对大量黄曲霉( aspergillus flavus)、米曲霉( aspergillus oryzae)等曲霉属黄绿组菌株的全基因组和产毒能力关联分析，发现菌株是否产黄曲霉毒素与 norb基因明显相关，即通过检测 norb基因缺失与否可以准确判别菌株是否产黄曲霉毒素。因此，本专利技术基于 norb基因优化设计了用于鉴定是否为产黄曲霉毒素菌株的引物，通过pcr 扩增来鉴定菌株是否产毒。所提供的用于鉴定是否为产黄曲霉毒素菌株的引物序列特异性高，pcr 扩增具有速度快、可信度高等特点，为快速、准确筛选不产黄曲霉毒素菌株提供了很好的技术手段，对控制黄曲霉毒素的污染具有重要意义。
技术实现思路
1、本专利技术涉及一种用来鉴定黄曲霉毒素产毒菌株的引物及应用，属于生物
本专利技术确定了黄曲霉毒素产生与
norb基因相关，提供的用于鉴定黄曲霉毒素产毒菌株的引物由norb-f和norb-r引物对组成，实验证明，本专利技术所提供的用于鉴定是否为黄曲霉毒素产毒菌株的引物序列特异性高，pcr 扩增鉴定具有速度快、可信度高等特点。
2、本专利技术是通过以下技术方案实现的：
3、（1）本专利技术所述引物对norb-f和norb-r特异于已有产黄曲霉毒素真菌pcr检测方法。
4、（2）本专利技术的norb-f和norb-r引物对组合，在利用pcr方法检测产黄曲霉毒素真菌方面的用途而言，所述产黄曲霉毒素真菌优选为黄曲霉( aspergillus flavus)、寄生曲霉( aspergillus parasiticus)、米曲霉( aspergillus oryzae)、酱油曲霉( aspergillus sojae)、集蜂曲霉（ aspergillus nomius）、假酸曲霉( aspergillus pseudotamarii)、 aspergillus bombycis和小菌核曲霉（ aspergillus minisclerotigenes）中的一种或多种。
5、（3）所述引物通过对黄曲霉 norb基因全序列分析，通过引物设计软件设计引物序列如下所示：
6、seq id no:1为norb-f：5’-tggggttttctgcaccacat-3’；seq id no:2为norb-r：5’-ccaggaggttcacttcgctt-3’。
7、（4）所述引物norb-f和norb-r在pcr反应体系中等量使用。
8、（5）该专利技术具体操作方法如下：以待测菌株的dna为模板，用引物norb-f和norb-r进行pcr反应，阴性对照(以无菌水作为模板)。pcr反应体系为：2×easytaq® pcrsupermix 25 µl，上下游引物（10 µmol/l）各25 µl，dna模板2 µl，ddh2o补足至50 µl。
9、（6）凝胶电泳检测pcr产物
10、用1×tae电泳缓冲液制备1%的琼脂糖凝胶(凝胶融化后冷却至60℃左右加入goldview染料进行染色)，将dl 2000 dna分子量标记物和pcr产物分别加入到对应的凝胶孔中，选择合适的电压进行电泳，最后用凝胶成像系统进行观察分析并记录。
11、（7）结果判定
12、本专利技术提供的norb-f和norb-r引物对扩增出大小约为773bp明亮条带且pcr空白对照扩增产物无条带即可判定菌株为产黄曲霉毒素菌株，若扩增条带无773bp明亮条带且pcr阳性对照扩增产物正常，则判定菌株为不产黄曲霉毒素菌株。
13、本专利技术的技术方案与现有技术相比，具有以下明显效果：
14、（1）本专利技术提供的引物对可用于鉴别黄曲霉( aspergillus flavus)、寄生曲霉( aspergillus parasiticus)、米曲霉( aspergillus oryzae)、酱油曲霉( aspergillus sojae)、集蜂曲霉（ aspergillus nomius）、假酸曲霉 ( aspergillus pseudotamarii)、 aspergillus bombycis和小菌核曲霉（ aspergillus minisclerotigenes）等菌株是否产黄曲霉毒素。
15、（2）本专利技术提供了用于评价黄曲霉菌株是否产毒的引物序列，该引物异性高，具本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用来鉴定是否为产黄曲霉毒素菌株的引物，其特征在于引物对为NorB-F和NorB-R，NorB-F如SEQ ID NO:1所示，NorB-R如SEQ ID NO:2所示。
2.如权利要求1所述一种用来鉴定是否为产黄曲霉毒素菌株的引物，其特征在于，PCR扩增的目的条带长度范围为750~800 bp。
3.如权利要求1所述的一种用来鉴定是否为产黄曲霉毒素菌株的引物，其特征在于，适用于黄曲霉Aspergillus flavus、寄生曲霉Aspergillus parasiticus、米曲霉Aspergillus oryzae、酱油曲霉Aspergillus sojae、集蜂曲霉Aspergillus nomius、假酸曲霉 Aspergillus pseudotamarii、Aspergillus bombycis、小菌核曲霉Aspergillus minisclerotigenes是否产黄曲霉毒素的鉴别。
【技术特征摘要】
1.一种用来鉴定是否为产黄曲霉毒素菌株的引物，其特征在于引物对为norb-f和norb-r，norb-f如seq id no:1所示，norb-r如seq id no:2所示。
2.如权利要求1所述一种用来鉴定是否为产黄曲霉毒素菌株的引物，其特征在于，pcr扩增的目的条带长度范围为750~800 bp。
3.如权利要求1所述的一种用来鉴定是否为产黄曲霉毒素菌株的引物，其特征在于，适用于黄曲霉as...
【专利技术属性】
技术研发人员：姚粟，蔡程山，陈娟，张天赐，白飞荣，张晶晶，马紫英，余逸飞，刘蕊，孙思远，
申请(专利权)人：中国食品发酵工业研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：
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