一种外泌体联合透明质酸提取方法技术

本发明专利技术公开了一种外泌体联合透明质酸提取方法，具体包括以下步骤：步骤一、外泌体提取；步骤二、调配分析；步骤三、分组试验；步骤四、图谱构建；本发明专利技术涉及细胞工程技术领域。该外泌体联合透明质酸提取方法，通过进行间充质干细胞外泌体的提取后，与透明质酸按照不同比例配置干预液，通过对小鼠不同软骨组织的表层细胞，获取不同浓度的骨料培养液，以干预液对不同浓度的骨料培养液进行干预效果分析，实现对间充质干细胞外泌体与透明质酸的配合研究，为间充质干细胞外泌体表达效果的提高提供研究方向。究方向。究方向。

【技术实现步骤摘要】
一种外泌体联合透明质酸提取方法


[0001]本专利技术涉及细胞工程
，具体为一种外泌体联合透明质酸提取方法。

技术介绍

[0002]外泌体是细胞外囊泡的一种类型，具有双层膜结构，直径约为40
‑
100nm，承载的蛋白质、mRNA、miRNA等生物活性分子是其发挥作用的关键，通过相关通路，影响受体细胞的基因表达，翻译某些功能蛋白或者沉默某些功能基因表达，从而调控细胞功能。
[0003]对外泌体进行表达效果判定时，往往直接通过老鼠试验的方式进行分析，但是，常规外泌体表达分析时，往往是单纯采用外泌体试验，其仅仅通过试验外泌体浓度的变化来进行表达效果的判定，缺乏通过添加物质进行表达效果的试验分析，无法进行提高外泌体表达效果的研究分析，基于此，特提出一种外泌体联合透明质酸提取方法，对间充质干细胞外泌体与透明质酸的配合进行研究，实现对间充质干细胞外泌体与透明质酸的配合研究，为间充质干细胞外泌体表达效果的提高提供研究方向。

技术实现思路

[0004](一)解决的技术问题
[0005]针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种外泌体联合透明质酸提取方法，解决了常规单纯利用外泌体浓度的变化来进行表达效果的判定，缺乏通过添加物质进行表达效果的试验分析，无法进行提高外泌体表达效果研究分析的问题。
[0006](二)技术方案
[0007]为实现上述目的，本专利技术提供了如下技术方案：一种外泌体联合透明质酸提取方法，具体包括以下步骤：
[0008]步骤一、外泌体提取：从25岁
‑
30岁健康产妇婴儿脐带上剥取华通氏胶，根据组织块贴壁法进行接种，隔天补液换液，直到间充质干细胞爬出，细胞爬出融合度85％时进行传代扩增培养，传代至P5代时收集培养液，采用离心法在小于4℃的环境中从培养液中提取出外泌体悬液，进行分装后，在
‑
80℃的环境中保存，避免反复冻融；
[0009]步骤二、调配分析：选取小鼠不同软骨组织的表层细胞，浸泡在带有营养液的培养皿中进行细胞培育，获得不同部位的骨料培养液，并将骨料培养液稀释至不同浓度后进行分别存储；
[0010]步骤三、分组试验：直接将步骤一中分装保存的外泌体悬液与透明质酸按照外泌体悬液：透明质酸＝10:1、外泌体悬液：透明质酸＝3:1、外泌体悬液：透明质酸＝1:1、外泌体悬液：透明质酸＝1:3和外泌体悬液：透明质酸＝1:10的比例配置后，得到五组干预液，将五组干预液分别投入到步骤二中不同浓度的骨料培养液中，留取空白对照后，在无菌室中培育设定时间后，获得与不同浓度骨料培养液对应的对比例和空白对照例，后将与对应干预液中外泌体悬液的含量相同的外泌体悬液投入到骨料培养液中，在无菌室中培育设定时间后，获得与不同浓度骨料培养液对应的参照例；
[0011]步骤四、图谱构建：对步骤三中的不同对比例、空白对照例和参照例进行细胞采集对比，获得若干组干预液与不同部位的骨料培养液中对应细胞的关系图谱，对透明质酸的添加量与不同软骨组织的关系进行分析。
[0012]通过采用上述技术方案，进行间充质干细胞外泌体的提取后，与透明质酸按照不同比例配置干预液，通过对小鼠不同软骨组织的表层细胞，获取不同浓度的骨料培养液，以干预液对不同浓度的骨料培养液进行干预效果分析，实现对间充质干细胞外泌体与透明质酸的配合研究，为间充质干细胞外泌体表达效果的提高提供研究方向。
[0013]本专利技术进一步设置为：所述步骤一中的离心法包括：
[0014]利用低速离心收集上清的方式去除细胞成分和死细胞，具体的，以400
‑
1200rpm的转速对300g培养液离心10min，除去细胞成分，收集上清后，以1500
‑
3500rpm的转速对2000g除去细胞成分的培养液离心10min，去除死细胞，收集上清；
[0015]利用高速离心收集上清的方式消除细胞碎片，具体的，以18000
‑
20000rpm的转速对10000g除去死细胞后的培养液离心70min，消除细胞碎片，收集上清；
[0016]利用高速离心收集沉淀的方式收集外泌体，具体的，以18000
‑
20000rpm的转速对10000g消除细胞碎片后的培养液离心70min，收集沉淀，得到外泌体；
[0017]将收集的外泌体重悬于PBS缓冲液中，以高速离心收集沉淀的方式消除污染蛋白质，具体的，以18000
‑
20000rpm的转速对10000g重悬于PBS缓冲液的外泌体离心70min，消除污染蛋白质，收集沉淀，得到脐带间充质干细胞分泌的外泌体。
[0018](三)有益效果
[0019]本专利技术提供了一种外泌体联合透明质酸提取方法。具备以下有益效果：
[0020]该专利技术通过进行间充质干细胞外泌体的提取后，与透明质酸按照不同比例配置干预液，通过对小鼠不同软骨组织的表层细胞，获取不同浓度的骨料培养液，以干预液对不同浓度的骨料培养液进行干预效果分析，实现对间充质干细胞外泌体与透明质酸的配合研究，为间充质干细胞外泌体表达效果的提高提供研究方向。
附图说明
[0021]图1为本专利技术流程示意图。
具体实施方式
[0022]下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0023]请参阅图1，本专利技术实施例提供一种技术方案：一种外泌体联合透明质酸提取方法，具体包括以下步骤：
[0024]步骤一、外泌体提取：选择25岁
‑
30岁健康产妇婴儿脐带，脐带≥15cm，剥取华通氏胶，根据组织块贴壁法进行接种，隔天补液换液，直到间充质干细胞爬出，细胞爬出融合度85％时进行传代扩增培养，传代至P5代时收集培养液，采用离心法从培养液中提取出外泌体悬液，进行分装保存；
[0025]步骤二、调配分析：选取小鼠不同软骨组织的表层细胞，浸泡在带有营养液的培养皿中进行细胞培育，获得不同部位的骨料培养液，并将骨料培养液稀释至1/2、1/3、1/5和1/10浓度后进行分别存储，其中相同浓度的骨料培养液设置有六个，六个相同浓度的骨料培养液划分为一组，共将骨料培养液分为四组；
[0026]步骤三、分组试验：直接将步骤一中分装保存的外泌体悬液与透明质酸按照外泌体悬液：透明质酸＝10:1、外泌体悬液：透明质酸＝3:1、外泌体悬液：透明质酸＝1:1、外泌体悬液：透明质酸＝1:3和外泌体悬液：透明质酸＝1:10的比例配置后，得到五组干预液，将五组干预液分别投入到步骤二中的四组不同浓度的骨料培养液中，其中每组骨料培养液留取一个不添加干预液作为空白对照，在无菌室中培育设定时间后，获得与不同浓度骨料培养液对应的对比例和空白对照例，后将与对应干预液中外泌体悬液的含本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种外泌体联合透明质酸提取方法，其特征在于：具体包括以下步骤：步骤一、外泌体提取：从新鲜脐带上剥取华通氏胶，根据组织块贴壁法进行接种，隔天补液换液，直到间充质干细胞爬出，细胞爬出融合度85％时进行传代扩增培养，传代至P5代时收集培养液，采用离心法从培养液中提取出外泌体悬液，进行分装保存；步骤二、调配分析：选取小鼠不同软骨组织的表层细胞，浸泡在带有营养液的培养皿中进行细胞培育，获得不同部位的骨料培养液，并将骨料培养液稀释至不同浓度后进行分别存储；步骤三、分组试验：将步骤一中分装保存的外泌体悬液与透明质酸按照不同比例配置后，得到若干组干预液，将若干组干预液分别投入到步骤二中不同浓度的骨料培养液中，留取空白对照后，在无菌室中培育设定时间后，获得与不同浓度骨料培养液对应的对比例和空白对照例，后将与对应干预液中外泌体悬液的含量相同的外泌体悬液投入到骨料培养液中，在无菌室中培育设定时间后，获得与不同浓度骨料培养液对应的参照例；步骤四、图谱构建：对步骤三中的不同对比例、空白对照例和参照例进行细胞采集对比，获得若干组干预液与不同部位的骨料培...

【专利技术属性】
技术研发人员：张世冬，魏亮，刘婷，
申请(专利权)人：中科聚研吉林干细胞科技有限公司，
类型：发明
国别省市：