一种检测细胞在水凝胶基底上分子牵引力及动态的方法技术

本发明专利技术公开了一种检测细胞在水凝胶基底上分子牵引力及动态的方法，属于生命科学与医学领域。本发明专利技术方法包括如下步骤：通过金纳米粒子转接将分子张力探针加载在水凝胶基底表面，将细胞接种于水凝胶基底上，进行分子张力探针荧光信号成像及信号处理实现分子牵引力检测，或加入分子张力探针的互补链后再进行分子张力探针荧光信号成像及信号处理实现分子牵引力动态检测。本发明专利技术方法保证了充足的分子张力探针加载量，为细胞提供足够粘附位点的同时有效抑制背景荧光，提高了分子张力探针荧光信号的信噪比，极大提高了水凝胶基底上细胞牵引力检测的空间分辨率，具有良好的开发和应用前景。前景。前景。

【技术实现步骤摘要】
一种检测细胞在水凝胶基底上分子牵引力及动态的方法


[0001]本专利技术属于生命科学与医学领域，具体涉及一种检测细胞在水凝胶基底上分子牵引力及动态的方法。

技术介绍

[0002]细胞与胞外基质间的牵引力对于细胞功能、结构和生理过程发挥着关键作用，这种牵引力介导的信号传导使细胞能够感知外界环境的变化，并做出相应的反应，异常的牵引力可能导致肿瘤转移、组织纤维化和慢性炎症等疾病的发生和进展。深入了解和研究牵引力调控的机制对于深入理解疾病的发生和发展机制具有重要意义。通过干预细胞牵引力的失衡，例如开发针对相关分子的药物或治疗策略，有望为相关疾病的治疗提供新的途径。
[0003]传统对细胞牵引力的检测依赖于利用微米级的粒子或标记材料嵌入到细胞所附着的水凝胶基底中。当细胞施加力量时，这些粒子会受到位移，从而产生可观察到的形变。通过观察标记材料的位移，结合相应的数学模型和图像处理算法，可以推导出细胞施加的牵引力分布。尽管牵引力显微镜(TFM)在研究细胞力学行为方面具有重要的应用价值，但仍然存在一些技术和方法上的局限性和挑战。例如空间分辨率限制在2μm、力学反演的不确定性、z轴方向力学信号难检测等等。这些缺点限制了我们对力学传感分子机制的理解以及牵引力的临床应用。
[0004]Salaita的实验室最近率先专利技术了基于分子张力探针的牵引力显微镜(mTFM)，该技术采用机械敏感的荧光分子来成像和量化活细胞膜受体所产生的皮牛级别的力。使用mTFM，研究人员能够实时成像活细胞中整合素和T细胞受体等跨膜受体的分子力，并揭示单个受体传递的皮牛级别的力是如何介导细胞粘附和T细胞活化。尽管mTFM可以在分子水平上测量细胞牵引力，但该技术目前仅限于研究在玻璃基底表面的细胞牵引力，玻璃基底的硬度要远高于生理条件下的胞外基质硬度，在利用水凝胶模拟生理胞外基质硬度下利用分子张力探针检测细胞牵引力是现在面临的技术难点。据我们所知，这主要是由于水凝胶的复杂化学和物理结构特性使得在其表面上特异性修饰分子张力探针具有挑战性。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于克服现有技术存在的不足，提供一种检测细胞在水凝胶基底上分子牵引力及动态的方法。本专利技术以可控和可靠的方式在软水凝胶表面上功能化分子张力探针用于分子级的细胞牵引力成像。同时，荧光纳米球也被在加载到同一水凝胶表面，这使本专利技术能够将mTFM与传统的TFM结合起来，收集更全面的数据，包括分子牵引力、总细胞牵引力和力方向。
[0006]本专利技术的目的通过下述技术方案实现：
[0007]一种检测细胞在水凝胶基底上分子牵引力及动态的方法，包括如下步骤：通过金纳米粒子转接将分子张力探针加载在水凝胶基底表面，将细胞接种于水凝胶基底上，进行分子张力探针荧光信号成像及信号处理实现分子牵引力检测，或加入分子张力探针的互补
链后再进行分子张力探针荧光信号成像及信号处理实现分子牵引力动态检测。
[0008]在一些实施方案中，所述的分子张力探针可以选择RSDTP、Hairpin、TGT、PEG等分子张力探针，探针与基底连接端需进行修饰用于连接金纳米粒子，所述的修饰优选为巯基修饰；探针与细胞连接端需根据想要研究的细胞膜蛋白进行相应配体的修饰。所述的分子张力探针可为一种或多种，多种分子张力探针时，不同探针携带不同的荧光标记。
[0009]在一些实施方案中，所述的水凝胶基底可以选择PA、MeHA等水凝胶，水凝胶硬度可以通过配方进行调整，凝胶基底需进行修饰用于连接金纳米粒子，所述的修饰优选为巯基修饰。
[0010]在一些实施方案中，所述的水凝胶基底中含有荧光微珠，优选通过包括如下步骤的方法得到含有荧光微珠水凝胶基底：准备两片盖玻片，一片修饰有醛基、一片修饰有荧光微珠，将水凝胶混合液滴加到修饰有醛基的盖玻片上，再盖上修饰有荧光微珠盖玻片，水凝胶混合液凝固后揭下修饰有荧光微珠盖玻片，得到含有荧光微珠的水凝胶基底。通过掺加荧光微珠实现与传统牵引力显微镜联用。
[0011]在一些实施方案中，通过金纳米粒子转接将分子张力探针加载在水凝胶基底表面有两种可行的方法。第一种方法是先在经巯基修饰的水凝胶基底表面孵育金纳米粒子，再孵育巯基修饰的分子张力探针。这种方法的优点是非常简单，可操作性比较强。第二种方法是将巯基修饰的分子张力探针先负载在金纳米粒子上，然后一起在经巯基修饰的水凝胶基底表面孵育。该方法的优点是可以进一步保证不同条件下金和探针之间的比例固定在基底上，特别是在使用混合探针时。经过实验，效果类似。
[0012]上述第一种方法：水凝胶基底先加载金纳米粒子，再加载分子张力探针。具体包括如下步骤：经巯基修饰的水凝胶基底用浓度100mM以下的柠檬酸钠溶液稀释的1
‑
10nM 5
‑
40nm的金纳米粒子孵育使金纳米粒子加载到水凝胶基底上，纯水冲洗并立即泡于PBS中，再用含800mM
‑
5M NaCl的PBS稀释的50
‑
1000nM的巯基修饰的分子张力探针孵育使分子张力探针加载到金纳米粒子上，PBS清洗，置于PBS中待用。
[0013]上述第二种方法：分子张力探针先与金纳米粒子复合，再加载到水凝胶基底。具体包括如下步骤：终浓度100mM以下的5
‑
40nm的金纳米粒子、0
‑
10μM COOH
‑
PEG8
‑
SH和50
‑
1000nM巯基修饰的分子张力探针混合，混合溶液经冷冻、解冻后或混合溶液中加入NaCl使其浓度达到0.1M以上后，与经巯基修饰的水凝胶基底孵育使分子张力探针金纳米粒子复合物加载在水凝胶基底上，PBS清洗，保存在PBS中待用。
[0014]在一些实施方案中，所使用分子张力探针为Hairpin探针时，可以使用200
‑
1000nM互补链进行力学动态检测；所使用分子张力探针为RSDTP探针时，可以使用1
‑
10μM互补链进行力学动态检测。
[0015]本专利技术在检测细胞牵引力方面提供了一种定量和可视化的方法。首先，它可以帮助研究人员深入了解细胞
‑
基质之间的相互作用机制。通过测量细胞的牵引力，可以揭示细胞黏附、迁移和转变形态的过程，以及细胞机械性质的变化。其次，本专利技术对于癌症研究非常重要。它可以帮助评估肿瘤细胞的侵袭和转移能力，提供了关于肿瘤转移机制的重要信息。此外，本专利技术还可用于评估药物对细胞牵引力的影响，为药物筛选和个体化治疗提供指导。最后，本专利技术的应用也拓展到生物材料和组织工程领域。通过了解细胞与材料表面之间的牵引力，可以改进人工器官的设计和功能，并促进组织修复和再生的研究。这些应用显示
了本专利技术在生命科学与医学中的广泛潜力，帮助人们更好地理解和干预细胞行为。
[0016]本专利技术方法的有益效果是
[0017]1)本专利技术利用金纳米粒子转接分子张力探针，可以实现水凝胶基底表面分子张力探针的高效、可控加载，成本较低。
[00本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测细胞在水凝胶基底上分子牵引力及动态的方法，其特征在于：包括如下步骤：通过金纳米粒子转接将分子张力探针加载在水凝胶基底表面，将细胞接种于水凝胶基底上，进行分子张力探针荧光信号成像及信号处理实现分子牵引力检测，或加入分子张力探针的互补链后再进行分子张力探针荧光信号成像及信号处理实现分子牵引力动态检测。2.根据权利要求1所述的检测细胞在水凝胶基底上分子牵引力及动态的方法，其特征在于：所述的分子张力探针包括RSDTP、Hairpin、TGT、PEG分子张力探针中的至少一种。3.根据权利要求1所述的检测细胞在水凝胶基底上分子牵引力及动态的方法，其特征在于：所述的水凝胶基底包括PA、MeHA水凝胶。4.根据权利要求1所述的检测细胞在水凝胶基底上分子牵引力及动态的方法，其特征在于：所述的分子张力探针与基底连接端有用于连接金纳米粒子的修饰，所述的水凝胶基底上有用于连接金纳米粒子的修饰。5.根据权利要求4所述的检测细胞在水凝胶基底上分子牵引力及动态的方法，其特征在于：所述的修饰为巯基修饰。6.根据权利要求1所述的检测细胞在水凝胶基底上分子牵引力及动态的方法，其特征在于：所述的分子张力探针与细胞连接端有配体修饰。7.根据权利要求1所述的检测细胞...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘郑，王文旭，陈伟，
申请(专利权)人：武汉大学，
类型：发明
国别省市：