固醇脱氢酶突变体、载体、工程菌及其应用制造技术

本发明专利技术提供一种固醇脱氢酶突变体、载体、工程菌及其应用，本发明专利技术通过蛋白质工程改造，对野生型固醇脱氢酶的氨基酸序列进行一到两个突变，并利用原核表达成功获得了活性提升的固醇脱氢酶有益突变体，为我们的工业化生成熊去氧胆酸提供了强有力的技术支持。去氧胆酸提供了强有力的技术支持。

【技术实现步骤摘要】
固醇脱氢酶突变体、载体、工程菌及其应用


[0001]本专利技术涉及一种源自扭链瘤胃球菌的固醇脱氢酶突变体及其基因、载体、酶、工程菌构建和应用。

技术介绍

[0002]固醇脱氢酶，是一类烟酰胺依赖的氧化还原酶。大多数已知的微生物短链脱氢酶是单体蛋白，也存在多聚蛋白，MW约26～28kDa。它们催化氧化/还原中性类固醇、胆汁酸和其他类固醇衍生物的羟基基团，并广泛用于其选择性修饰。目前报道的固醇脱氢酶种类繁多，如3α
‑
HSDH、7α
‑
HSDH、7β
‑
HSDH、12α
‑
HSDH和12β
‑
HSDH等。天然存在的固醇脱氢酶往往存在活性低、稳定性低等缺点，难以满足工业生产需求。酶活性的改造获得具有工业属性的酶制剂是酶工业化应用的关键。
[0003]熊去氧胆酸(3α,7β
‑
二羟基
‑
5β
‑
胆甾烷24
‑
酸，UDCA),作为治疗各种肝脏疾病的有效药物成分一直备受关注。近几年，随着科学技术的发展，UDCA的其他有益生理作用被大量报道，如抗肝纤维化、抗炎和调节脂质代谢，特别是作为化学保护或化疗药物在癌症治疗中的潜力，因此市场需求量持续升高。其合成通常是基于Kanazawa报道的以胆酸(CA)为原料，通过七步化学合成来实现。国内由于鸡、鸭等禽类资源丰富，多以鸡、鸭胆膏为起始原料，经提取、纯化得到鹅去氧胆酸，后通过7位羟基的氧化和不对称还原生产熊去氧胆酸。/>[0004]鹅去氧胆酸经氧化还原仅两步可合成熊去氧胆酸，中间产物为7
‑
酮基石胆酸(3α
‑
羟基
‑7‑
羰基
‑
5β
‑
胆烷酸,7
‑
KLCA)，氧化还原方法有化学法和酶催化法。化学法具有一定的危险性，如加氢还原需要高压反应，而酶法加氢还原具有环境友好的特点，因此酶法还原越来越受到大家的青睐。
[0005]通过基因工程获得的固醇脱氢酶7β
‑
HSDH，可催化7
‑
KLCA合成UDCA，其最适pH范围是pH6.6
‑
7.2，但在此pH条件下7
‑
KLCA在水中的溶解度低于1％，7
‑
KLCA在中性pH附近的低水溶性成为提高反应速度，增加投料浓度，降低生产成本的技术瓶颈。且在水相反应体系中，常引入葡萄糖脱氢酶实现辅酶再生。葡萄糖/GDH辅因子再生系统从80年代起就与HSDH催化的还原反应耦合。该系统优点在于共底物葡萄糖是廉价的，并且当葡萄糖被氧化为葡萄糖酸内酯时，反应是不可逆的，葡萄糖酸内酯会自发水解。然而，当在高浓度胆汁酸溶液存在下时，反应混合物开始凝胶化，从而影响反应的进程，无法实现高转化率。

技术实现思路

[0006]本专利技术为了弥补现有技术的不足，开发了一种针对熊去氧胆酸中间体7
‑
酮石胆酸生成熊去氧胆酸的方法，具体的引入异丙醇/羰基还原酶(SCR)实现辅因子再生，异丙醇即作为辅底物，也作为助溶剂。进一步通过蛋白质工程改造，成功获得了活性提升的固醇脱氢酶有益突变体，开发了7β
‑
HSDH突变体7β
‑
HSDH
‑
S51Y/P202Y(7β
‑
HSDH
M2
)，利用上述方法体系和突变体基因重组菌作为生物催化剂发展UDCA的生物催化合成工艺技术。
[0007]本专利技术所采用的技术方案是：
[0008]第一方面，本专利技术提供一种源自扭链瘤胃球菌Ruminococcus torques的固醇脱氢酶突变体，所述固醇脱氢酶的突变体是将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列进行以下一个或两个位点的突变获得的:(1)第202位脯氨酸突变为酪氨酸、天冬酰胺、丙氨酸、甘氨酸、赖氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸或缬氨酸；(2)第51位丝氨酸突变为酪氨酸、谷氨酸、赖氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、色氨酸、甘氨酸或缬氨酸。
[0009]优选地，所述固醇脱氢酶的突变体是将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列进行以下一个或两个位点的突变获得的：(1)第51位丝氨酸突变为酪氨酸；(2)第202位的脯氨酸突变为酪氨酸。
[0010]进一步优选地，所述固醇脱氢酶的突变体是将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列进行以下两个位点的突变获得的：第51位丝氨酸突变为酪氨酸，且第202位的脯氨酸突变为酪氨酸。其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
[0011]第二方面，本专利技术提供一种上述固醇脱氢酶突变体的表达质粒。
[0012]本领域人员知晓，上述表达质粒的载体可以为各种本领域常用的表达载体，在本专利技术的一个实施例中，所述表达质粒的载体为pET28a(+)，具体地，所述表达质粒是将所述固醇脱氢酶突变体的核苷酸序列插入到载体pET28a(+)的NcoI酶切位点和XhoI酶切位点之间得到的。
[0013]第三方面，本专利技术提供一种表达上述固醇脱氢酶突变体的基因工程菌。
[0014]本领域人员知晓，固醇脱氢酶突变体基因可以质粒的形式在宿主中进行表达，也可以插入宿主基因组进行表达。上述基因工程菌的宿主可以为各种本领域常用的宿主，在本专利技术的一个实施例中，所述基因工程菌的宿主为E.coli BL21(DE3)。具体地，在本专利技术的一个实施例中，所述基因工程菌是按如下方法得到的：将所述固醇脱氢酶突变体的核苷酸序列插入到载体pET28a(+)的NcoI酶切位点和XhoI酶切位点之间，得到表达质粒；将所述表达质粒转入E.coli BL21(DE3)的感受态细胞中，得到所述基因工程菌。
[0015]第四方面，本专利技术提供一种上述固醇脱氢酶突变体在制备熊去氧胆酸中的应用。
[0016]进一步，所述应用为：
[0017]以所述固醇脱氢酶突变体为催化剂，以7
‑
酮石胆酸(7
‑
KLCA)为底物，以异丙醇为辅底物，以pH7.0、100mM的PBS缓冲液(本专利技术的一个实施例为KPB缓冲液)为反应介质构成转化体系，在30℃、400～800rpm条件下进行反应，反应停止后(可通过液相判断)获得含熊去氧胆酸的反应液。
[0018]进一步，所述转化体系中，底物终浓度30～100g/L(优选为30g/L)，异丙醇的终浓度为30～70％(v/v)(优选40％(v/v))。
[0019]进一步，所述固醇脱氢酶突变体可以表达为所述固醇脱氢酶突变体的基因工程菌湿菌体、表达所述固醇脱氢酶突变体的基因工程菌湿菌体的细胞破碎液或所述固醇脱氢酶突变体的基因工程菌湿菌体经细胞破碎、蛋白纯化后分离出的纯酶液的形式加入。在本专利技术的一个实施例中，所述固醇脱氢酶突变体以表达所述固醇脱氢酶突变体的基因工程菌湿菌体的形式加入，所述固醇脱氢酶突变体的用量以本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种固醇脱氢酶突变体，其特征在于所述固醇脱氢酶的突变体是将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列进行以下一个或两个位点的突变获得的：(1)第202位脯氨酸突变为酪氨酸、天冬酰胺、丙氨酸、甘氨酸、赖氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸或缬氨酸；(2)第51位丝氨酸突变为酪氨酸、谷氨酸、赖氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、色氨酸、甘氨酸或缬氨酸。2.如权利要求1所述的固醇脱氢酶突变体，其特征在于所述固醇脱氢酶的突变体是将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列进行以下一个或两个位点的突变获得的：(1)第51位丝氨酸突变为酪氨酸，(2)第202位的脯氨酸突变为酪氨酸。3.如权利要求1所述的固醇脱氢酶突变体，其特征在于所述固醇脱氢酶的突变体是将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列进行以下两个位点的突变获得的：第51位丝氨酸突变为酪氨酸，且第202位的脯氨酸突变为酪氨酸。4.如权利要求1所述的固醇脱氢酶突变体的表达质粒。5.表达如权利要求1所述的固醇脱氢酶突变体的基因工程菌。6.如权利要求1所述的固醇脱氢酶突变体在制备熊去氧胆酸中的应用。...

【专利技术属性】
技术研发人员：薛亚平，李媛，程峰，郑裕国，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：