重组脯氨酸羟化酶、羟基化重组胶原蛋白及其制备方法与应用技术

本发明专利技术涉及多肽生物合成技术领域。具体公开了重组脯氨酸羟化酶、羟基化重组胶原蛋白及其制备方法与应用。重组脯氨酸羟化酶为如下A1或A2所示的蛋白质：A1氨基酸序列为SEQ ID NO.1的蛋白质；A2氨基酸序列为SEQ ID NO.1的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加若干氨基酸残基后得到的与SEQ ID NO.1同一性在90％或以上，且与A1具有相同功能的蛋白质。通过该羟化酶与重组胶原蛋白共表达，成功实现了重组胶原蛋白的翻译后羟基化，使其在结构和功能上更趋近于天然胶原蛋白。本发明专利技术通过多基因表达增强了该羟化酶的活性，提高了目标蛋白的羟基化率，使得异源生产的胶原蛋白具有优异的促细胞增殖能力。促细胞增殖能力。促细胞增殖能力。

【技术实现步骤摘要】
重组脯氨酸羟化酶、羟基化重组胶原蛋白及其制备方法与应用


[0001]本专利技术属于多肽生物合成
，具体涉及重组脯氨酸羟化酶、羟基化重组胶原蛋白及其制备方法与应用。

技术介绍

[0002]胶原蛋白是一类生物高分子蛋白的总称，是哺乳动物细胞外基质中主要结构蛋白，约占总蛋白含量的25％
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30％，广泛地分布于皮肤、关节、骨骼等部位，参与细胞的增值、分化、迁移和信号传递等生理行为，以此起到支撑、修复及抗衰老的作用。加之胶原蛋白拥有良好的稳定性、优异的生物相容性及低免疫原性等优点，使其被广泛应用于临床医学、保健食品、化妆品、生物材料及医疗器械等领域。目前已破解了至少49种胶原蛋白的基因编码，可指导合成的胶原蛋白类型可达28种。其中Ⅰ型和Ⅲ型作为真皮层中最主要的胶原蛋白类型，在医疗美容、护肤、护发产品中被广泛应用。
[0003]胶原蛋白富含重复的Gly
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X
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Y结构域，这些结构域是胶原蛋白形成三螺旋结构的基础，亦是胶原蛋白发挥活性功能的核心要素。其中，X和Y常为脯氨酸或羟脯氨酸，羟脯氨酸羟基能形成强氢键以此稳固三螺旋结构，进而提高胶原蛋白的强度和稳定性。当前，因传统提取方法受来源、分离纯化工艺、病毒感染等问题的限制，借助基因工程技术生产胶原蛋白已是近年来的主要手段。由于，以大肠杆菌为主的原核表达体系无法在翻译后进行近一步加工，使重组胶原蛋白缺乏羟基化及糖基化修饰，而导致产物稳定性和功能性不足，作用效果不理想。动植物细胞虽然具有完备的功能性细胞器，但其培养困难、纯化成本高，且产量低，为大规模生产带来了巨大难度。
[0004]目前，虽然已有专利CN102020716A报道了使用毕赤酵母表达人型胶原蛋白的方法，但胶原蛋白发挥功能依赖于其特殊的三螺旋结构，而羟脯氨酸对胶原蛋白形成稳定的三螺旋结构不可或缺，然毕赤酵母细胞自身却无法表达催化脯氨酸羟基化的4
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脯氨酸羟基化酶，所以该方法无法形成功能完备的重组胶原蛋白。专利CN104313053A利用杆状病毒在家蚕幼虫中共表达脯氨酸羟化酶与人源Ⅱ胶原蛋白，虽然在一定程度上实现了脯氨酸羟基化，但直接将两个亚基无间隔的连接在同一个质粒中融合表达，使得以α2β2形式构成四聚体的4
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脯氨酸羟基化酶(P4H)无法实现有效聚合及三维折叠，从而降低了酶活，影响后续羟基化反应，而且采用病毒侵染昆虫细胞的方式表达蛋白，不仅增加了操作难度，也提高了生产成本。因此迫切需要一种操作方便、成本低且易于生产高生物活性的重组人源胶原蛋白的方法。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于，针对现有技术的上述不足，提供了重组脯氨酸羟化酶、羟基化重组胶原蛋白及其制备方法与应用。
[0006]为实现上述目的，本专利技术采用如下的技术方案：
[0007]本专利技术的第一目的是提供一种重组脯氨酸羟化酶，所述重组脯氨酸羟化酶为如下A1或A2所示的蛋白质：A1氨基酸序列为SEQ ID NO.1的蛋白质；A2氨基酸序列为SEQ ID NO.1的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加若干氨基酸残基后得到的与SEQ ID NO.1同一性在90％或以上，且与A1具有相同功能的蛋白质。
[0008]本专利技术的第二目的是提供一种核酸分子，所述核酸分子编码上述的重组脯氨酸羟化酶。
[0009]进一步的，所述核酸分子包括如下a1或a2所示的核酸分子：a1编码区包括SEQ ID NO.2的核酸分子；a2核苷酸序列为SEQ ID NO.2的核酸分子。
[0010]本专利技术的第三目的是提供一种重组载体，包括上述的核酸分子。
[0011]本专利技术的第四目的是提供上述的重组脯氨酸羟化酶或者核酸分子或者重组载体在蛋白异源表达中提高目标蛋白中脯氨酸羟基化的应用。
[0012]本专利技术的第五目的是提供一种用于羟化重组胶原蛋白的脯氨酸的方法，包括以下步骤：S1、提供细胞，所述细胞表达上述的重组脯氨酸羟化酶；S2、将重组胶原蛋白添加至所述细胞中，所述重组胶原蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。
[0013]进一步的，还包括步骤S3、从所述细胞的上清液提取脯氨酸羟基化的重组胶原蛋白。
[0014]进一步的，所述细胞包括真核细胞或原核细胞，所述原核细胞为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌；所述真核细胞为毕赤酵母、酿酒酵母、动物细胞或植物细胞。
[0015]本专利技术的第六目的是提供一种羟基化重组胶原蛋白，采用上述的方法得到的。
[0016]本专利技术的第七目的是提供一种试剂盒，用于脯氨酸的羟基化，其特征在于，所述试剂盒包括如上述的细胞或者上述的重组载体。
[0017]本专利技术的第八目的是提供一种包含上述的羟基化重组胶原蛋白的组合物。
[0018]本专利技术的第九目的是提供一种通过将上述的羟基化重组胶原蛋白交联得到的交联蛋白制品。
[0019]本专利技术的第十目的是提供上述的羟基化胶原蛋白或者组合物或者制品在制备药物、生物材料、组织材料、医疗器械、化妆品或保健品中的应用。
[0020]与现有技术比较，本专利技术提供的技术方案带来的有益效果是：
[0021](1)本专利技术提供的重组脯氨酸羟化酶包含依次连接的4
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脯氨酸羟基化酶α亚基、P2A连接肽和4
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脯氨酸羟基化酶β亚基，通过重组脯氨酸羟化酶与重组胶原蛋白共表达，成功实现了重组胶原蛋白的翻译后羟基化，使其在结构和功能上更趋近于天然胶原蛋白。
[0022](2)本专利技术通过采用多基因表达的方式进一步增强了4
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脯氨酸羟基化酶的活性，提高了重组胶原蛋白的羟基化率，使异源生产的胶原蛋白亦拥有了优良的促细胞增殖的能力。
[0023](3)本专利技术采用毕赤酵母异源表达胶原蛋白是一种操作方便、参数便于控制、细胞增值快、表达蛋白稳定且可分泌至胞外易于纯化、同时具有翻译后修饰功能、成本低廉且适合大规模生产的方法。
附图说明
[0024]图1为本专利技术的重组脯氨酸羟化酶酶促反应原理图；
[0025]图2为本专利技术构建的重组脯氨酸羟化酶的重组质粒的结构示意图；
[0026]图3为本专利技术构建的重组胶原蛋白的重组质粒的结构示意图；
[0027]图4为本专利技术的rhCOL1、rhCOL2电泳图；
[0028]图5为本专利技术的P4H1和P4H2的酶活测定结果图；
[0029]图6为本专利技术的羟基化重组胶原蛋白促增殖作用试验结果图；
[0030]图7为本专利技术的羟基化重组胶原蛋白促增殖作用试验结果数据统计图。
具体实施方式
[0031]为使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合具体实施例和附图，对本专利技术的具体实施方式作进一步详细描述。
[0032]如无特别说明，本专利技术的实施例中的试剂和生物原料均通过商业途径购买。
[0033]其中，pfu DNA聚合酶试剂购自北京索莱宝科技有限公司；fastpfu DNA聚合本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组脯氨酸羟化酶，其特征在于，所述重组脯氨酸羟化酶为如下A1或A2所示的蛋白质：A1氨基酸序列为SEQ ID NO.1的蛋白质；A2氨基酸序列为SEQ ID NO.1的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加若干氨基酸残基后得到的与SEQ ID NO.1同一性在90％或以上，且与A1具有相同功能的蛋白质。2.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码如权利要求1所述的重组脯氨酸羟化酶。3.如权利要求2所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包括如下a1或a2所示的核酸分子：a1编码区包括SEQ ID NO.2的核酸分子；a2核苷酸序列为SEQ ID NO.2的核酸分子。4.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体包含如权利要求2
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3中任一项所述的核酸分子。5.如权利要求1所述的重组脯氨酸羟化酶或者如权利要求2
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3中任一项所述的核酸分子或者如权利要求4所述的重组载体在蛋白异源表达中提高目标蛋白中脯氨酸羟基化的应用。6.一种用于羟化重组胶原蛋白脯氨酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、提供细胞，所述细胞表达如...

【专利技术属性】
技术研发人员：温巧，容明强，谷陟欣，黄彪，陈俊材，
申请(专利权)人：成都佩德生物医药有限公司，
类型：发明
国别省市：