一种乙酰丙酮裂解酶突变体及一种胞外酶反应生成2-乙酰基环己酮的方法技术

本发明专利技术公开了一种乙酰丙酮裂解酶突变体及一种胞外酶反应生成2

【技术实现步骤摘要】
一种乙酰丙酮裂解酶突变体及一种胞外酶反应生成2
‑
乙酰基环己酮的方法


[0001]本专利技术属于生物工程
，具体涉及一种乙酰丙酮裂解酶突变体及一种胞外酶反应生成2
‑
乙酰基环己酮的方法。

技术介绍

[0002]2‑
乙酰基环己酮是作为内皮素转化酶抑制剂的一种重要中间体，还可作为昆虫激素的中间体(Albercla Am等，2000)。内皮素转化酶抑制剂的临床应用，为大量心血管疾病患者的治愈提供了可能。由国内外研究现状可知，研究合成内皮素转化酶抑制剂中间体2
‑
乙酰基环己酮有重大意义(Jasmin Jf等，2004)。其目前主要是化学合成法为主，分别可以通过以下途径：环己酮直接酰基化(张招贵，2006)；先生成烯胺，再利用乙酸酐酰基化(刘宝典，2005)；利用直链β
‑
二酮成环(黄宪，1983)；环己酮和吗啡啉以有机溶剂甲苯为共沸剂，以对甲苯磺酸为催化剂，进行缩合反应生成烯胺，然后加入缚酸剂三乙胺，滴加乙酰氯和有机溶剂的混合物，烯胺与乙酰氯发生亲核加成反应，生成亚胺正离子，最后加入浓盐酸对亚胺正离子进行水解生成研究产物2
‑
乙酰基环己酮(韩峰，2009)。化学合成法普遍存在产率低、副产物多、原料不易获得、价格昂贵、反应中需要用到金属有机催化剂、环保压力大等缺点，不符合当今低碳经济的需求。生物法能耗低、成本低、能够避免大量污染物的生成，和化学法相比优势明显。
[0003]2‑
乙酰基环己酮的生物合成方法尚未引起广泛关注。由于鲜有研究表明Dke1可以催化其他底物的案例，因此扩大Dke1催化的底物谱十分重要。同时，由于乙酰丙酮对微生物细胞具有毒性(Water Research等，1980),2
‑
乙酰基环己酮与乙酰丙酮结构类似，可能具有较强的毒性作用，致使2
‑
乙酰基环己酮的产量还比较低。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是为了解决如何提高胞外酶反应生成2
‑
乙酰基环己酮产量的技术问题。对于解决全细胞合成体系中Dke1底物种类受限问题以及2
‑
乙酰基环己酮对于细胞的毒性抑制问题。
[0005]本专利技术提供一种乙酰丙酮裂解酶突变体，所述突变体是以氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的乙酰丙酮裂解酶为出发序列，突变第105位的氨基酸获得的突变体。
[0006]进一步地限定，将105位的甘氨酸突变为丙氨酸。
[0007]本专利技术还提供一种编码上述的突变体的基因。
[0008]本专利技术提供一种重组载体，所述重组载体携带上述的编码基因。
[0009]进一步地限定，所述重组载体的出发载体为pET系列、Duet系列、pGEX系列、pHY300、pHY300PLK、pPIC3K或pPIC9K系列中的任意一种。
[0010]本专利技术提供一种重组微生物细胞，携带上述基因或者表达上述的突变体的微生物细胞。
[0011]本专利技术提供上述的突变体、上述的基因、上述的载体或上述所述重组微生物细胞在提高2
‑
乙酰基环己酮产量中的应用。
[0012]本专利技术一种胞外酶反应生成2
‑
乙酰基环己酮的方法，包括以下步骤：
[0013]1)将上述乙酰丙酮裂解酶突变体基因连接到表达载体，获得重组载体；
[0014]2)将步骤1)所得重组载体转化宿主菌中，获得重组菌，重组菌发酵培养，获得培养液；
[0015]3)将步骤2)所得培养液经过预处理，获得乙酰丙酮裂解酶突变体蛋白酶液；
[0016]4)将步骤3)所得酶液与反应底物混合后反应，制备得到2
‑
乙酰基环己酮。
[0017]进一步地限定，步骤1)所述乙酰丙酮裂解酶突变体的基因序列如SEQ ID NO.2所示。
[0018]进一步地限定，步骤2)所述宿主菌为大肠杆菌。
[0019]进一步地限定，步骤1)所述发酵培养是将重组菌接种到发酵培养基中，在37℃、180rpm条件下培养至菌体浓度为OD600为0.6～0.8，加入终浓度0.2mM的IPTG后，在30℃条件下培养4～6h，获得培养液。
[0020]进一步地限定，将步骤2)所得培养液经过预处理后，利用超声波破碎培养液中的菌体得到破碎菌液，离心分离破碎菌液后保留上清液，再利用镍柱纯化上清液，获得乙酰丙酮裂解酶突变体Dke1G105A蛋白酶液。
[0021]进一步地限定，步骤2)所述预处理，是将培养液在4℃、10000rpm下离心5min后，弃去上清，用50mM pH7.4的磷酸盐缓冲溶液洗涤两次后，再用5mL上述磷酸盐缓冲液重悬；所述超声破碎，是利用超声破碎仪在20KHz、60W下处理20min；所述离心分离，是在4℃、13000rpm条件下离心15min。
[0022]进一步地限定，所述反应底物由以下成分组成：MgCl2·
6H2O 10mM，KCl 10mM，二硫苏糖醇1mM，Tris
‑
HCl buffer 20mM，FeSO4·
7H2O 0.5mM，1，2
‑
环己二酮10mM，乙酸10mM。
[0023]有益效果：本专利技术提供的方法，能够在体外利用酶反应将1，2
‑
环己二酮和乙酸转化为2
‑
乙酰基环己酮，产量达到14.22mg/L，对于解决全细胞合成体系中Dke1底物种类受限问题以及2
‑
乙酰基环己酮对于细胞的毒性抑制问题提供了新思路。
附图说明
[0024]图1体外酶反应产物2
‑
乙酰基环己酮GC
‑
MS检测结果。
[0025]图2为纯化酶液的SDS
‑
PAGE检测结果。
具体实施方式
[0026]乙酰丙酮裂解酶基因：Dke1
[0027]大肠杆菌(Escherichia coli):E.coli
[0028]“过量表达”或“过表达”指特定的基因在生物体中大量表达，表达量超过正常水平(即，野生型表达水平)，可以通过增强内源表达或引入外源基因来实现。
[0029]下面通过实例来进一步阐明本专利技术。但本专利技术并不限于以下实例。
[0030]下述实施例中所使用的实验方法若无特殊说明，均为常规方法。
[0031]下述实施例中所使用的材料、试剂等若无特殊说明，均可从商业途径获得。
[0032]培养基配方：
[0033]LB液体培养基：5g/L酵母粉，10g/L NaCl，10g/L蛋白胨，pH 7。
[0034]LB固体培养基：5g/L酵母粉，10g/L NaCl，10g/L蛋白胨，15g/L琼脂，pH 7。
[0035]摇瓶发酵培养基：20g/L葡萄糖，5g/L酵母粉，10g/L NaCl，10g/L蛋白胨，pH 7。
[0036]本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种乙酰丙酮裂解酶突变体，其特征在于，所述突变体是以氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的乙酰丙酮裂解酶为出发序列，突变第105位的氨基酸获得的突变体。2.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于，将105位的甘氨酸突变为丙氨酸。3.编码权利要求1或2所述的乙酰丙酮裂解酶突变体突变体的基因。4.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体携带权利要求3所述的编码基因。5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体的出发载体为pET系列、Duet系列、pGEX系列、pHY300、pHY300PLK、pPIC3K或pPIC9K系列中的任意一种。6.一种重组微生物细胞，其特征在于，携带权利要求1或2所述的基因或者表达权利要求1所述的突变体的微生物细胞。7.权利要求1或2所述的突变体、权利要求3所述的基因、权利要求4或5所述的载体或权利要求6所述的重组微生物细胞在提高2
‑
乙酰基环己酮产量中的应用。...

【专利技术属性】
技术研发人员：咸漠，赵广，周怡斐，冯新军，刘晔菲，
申请(专利权)人：中国科学院青岛生物能源与过程研究所，
类型：发明
国别省市：