一种利用大肠杆菌生物降解黄体酮的方法技术

本发明专利技术涉及一种利用大肠杆菌生物降解激素类药物黄体酮的方法，属于生物技术领域。本发明专利技术通过构建大肠杆菌基因工程菌株，在表达P450s CYP260A1S276I的基因上，引入异源的氧化还原伙伴。该全细胞系统在静息细胞时可以对黄体酮进行羟基化反应，首先进行黄体酮到17

【技术实现步骤摘要】
一种利用大肠杆菌生物降解黄体酮的方法

：
[0001]本专利技术涉及一种利用大肠杆菌生物降解激素类药物黄体酮的方法，属于生物


技术介绍
：
[0002]黄体酮(progesterone)及其衍生物是一类重要的类固醇药物，临床医学上黄体酮用于先兆性流产、习惯性流产等闭经或闭经原因的反应性诊断等。它对子宫内膜的分泌转化、蜕膜化过程、维持性周期及保持妊娠等起重要的作用，也是女用口服避孕药的主要成分，但大剂量使用时会抑制垂体促性腺激素的分泌，产生抑制排卵作用。近年来研究表明，黄体酮的作用已远超出生殖功能的范畴，它不仅可在神经系统中合成分泌，又能影响神经系统的结构和功能，可以用于治疗顽固性腹水、睡眠暂停综合征、慢性呼吸衰竭和输尿管结石等，在临床上起着越来越重要的作用。而且，由于黄体酮对雀斑美容的良好疗效，所以也被广泛的应用于化妆品中。
[0003]随着黄体酮的广泛应用，其生产应用过程中所产生的废水对环境污染也日益加剧，给人类健康带来了严重威胁。药物中的黄体酮经过人体或动物体吸收代谢后排入污水系统或环境水体，个人护理品中的黄体酮使用后直接进入污水管网中。而且由于医药业和化妆品行业大量而频繁地使用，导致黄体酮形成以痕量浓度长期存在于水环境之中的假性持续性现象，在地表水体和地下水体中，都有一定数量的黄体酮存在，且具有很强的持久性和潜在的生物累积性，可能转化、生物降解、吸附在污泥上，最终出现在河流、湖泊。随着对类固醇激素研究的深入和检测技术的发展，在畜禽粪污、污水处理厂出水、土壤、河水、河流底泥，甚至地下水等环境介质中不断有各种类固醇激素的检出报道。黄体酮没有特异性，对所有的生命有机体均可产生生物效应，即便是在低于浓度级也会产生内分泌效应，它能稳定地吸附在微小颗粒的表面且有较高的生物累积潜能，如影响到其他生物体的生理结构、导致出现药物抗性等，给生态环境和人类健康带来了一定的潜在风险。
[0004]目前污水处理厂在处理医院废水和生活污水时一般都是采用的常规处理技术和工艺，无法彻底清除水中的黄体酮，当自来水厂采用地下水作为饮用水源时，通常不能把黄体酮减少到可以接受的浓度，通过间接可饮用水的回用、城市污水处理厂的排放，黄体酮可能暴露于环境并最终存在于饮用水中。
[0005]国内外处理黄体酮废水的方法主要是物化法。研究表明上述处理方法存在一定的局限性。物化法处理过程受到pH值、氧化剂投加量、反应温度、反应时间等因素的影响，这种方法过程复杂繁琐所需时间长、易引起二次污染、而且处理效果差。综合考虑环境和经济因素，微生物降解被认为是目前去除环境中类固醇激素物质的一种重要途径，亦是最为经济绿色的方法之一。一直以来，环境中的研究主要集中在雌激素，对于孕激素物质的研究尤其是其降解去除方面的研究较少，养殖场周边受纳环境及地下水中频繁检出黄体酮酮等类固醇激素物质，表明现有污水处理工艺对该类化合物的去除能力有限，有必要研发高效的、有针对性的和高适用性的微生物降解去除方法。
[0006]细胞色素P450单加氧酶是生物技术应用中非常有用的生物催化剂，因为它们可以对广泛的有机分子进行多种反应。P450酶存在于大多数生物体中，能够催化黄体酮的羟基化反应，以高度区域选择性和立体选择性，在温和条件下，利用分子氧和通过适当的氧化还原伙伴蛋白(如铁氧还蛋白和铁氧还蛋白还原酶)从氢化物供体NAD(P)H的双电子转移进行催化反应，将氧插入黄体酮的非活化CH键中。
[0007]本申请研究利用纤维素假单胞菌菌株So ce56的其中一个P450s CYP260A1S276I，发现其不但具有转化黄体酮的17位羟基化活性，而且还具有将黄体酮全部水解的活性。具体方式为构建大肠杆菌基因工程菌株，在表达P450s CYP260A1S276I的基因的基础上，引入异源的氧化还原伙伴。该全细胞系统在静息细胞时可以对黄体酮进行羟基化反应，转化黄体酮为17
ɑ
‑
羟基黄体酮，之后该系统可以降解17
ɑ
‑
羟基黄体酮并生成新物质，并在22～60h内就可以达到完全降解的效果，具有较高的降解速率，该菌株具有的能催化黄体酮完全降解的应用为国内外首次报道，可较高效地应用于含黄体酮污水的微生物处理工艺中，具有较好的应用前景。

技术实现思路
：
[0008]本专利技术要解决的的技术问题是提供一种高效的降解黄体酮的全细胞系统，实现对黄体酮的微生物降解，大幅降低处理成本，对于黄体酮的污染治理具有重要意义。
[0009]本专利技术提供的技术方案之一，是一种黄体酮羟化酶CYP260A1的突变体S276I(以下简称CYP260A1 S276I)在降解黄体酮中的应用，该酶能够实现黄体酮的完全降解，所述黄体酮羟化酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1，核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0010]进一步地，所述降解黄体酮的反应体系采用异源多酶催化的人工电子传递系统，包括来源于牛的肾上腺素Adx4
‑
108和来源大肠杆菌(Escherichia coli str.K
‑
12substr.MG1655)的铁氧还蛋白酶Fpr；
[0011]进一步地，所述肾上腺素Adx4
‑
108，其氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，基因序列如SEQ ID NO：4所示；
[0012]进一步地，所述铁氧还蛋白酶Fpr，其氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示，基因序列SEQ ID NO：6所示，Gene ID:948414。
[0013]本专利技术提供的技术方案之二，是一种能够生物降解黄体酮的基因工程菌株，所述基因工程菌株是在宿主细胞中对CYP260A1 S276I、Adx4
‑
108和Fpr的编码基因进行表达获得的；
[0014]进一步地，将CYP260A1 S276I、Adx4
‑
108和Fpr的编码基因按照Fpr
‑
CYP
‑
Adx的顺序(5
’‑3’
的顺序)进行表达；
[0015]进一步地，所述宿主细胞包括但不限于大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌；
[0016]优选地，所述宿主细胞为大肠杆菌BL21；
[0017]进一步地，通过将CYP260A1 S276I、Adx4
‑
108和Fpr的编码基因构建重组表达载体进行表达；
[0018]所述重组表达载体使用的表达质粒包括但不限于pCDFDuet
‑
1、pET17b、pET22b、pET28a；
[0019]优选地，所述重组表达载体使用的表达质粒为pCDFDuet
‑
1质粒；
[0020]更优选地，所述重组表达载体使用的表达质粒为pET17b质粒；
[0021]优选地，将CYP260A1 S276I、Adx4
‑
108和Fpr的编码基因按照Fpr
‑
CYP
‑
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.黄体酮羟化酶CYP260A1的突变体S276I在降解黄体酮中的应用，其特征在于，该酶能够实现黄体酮的完全降解，所述黄体酮羟化酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述降解黄体酮的反应体系采用异源多酶催化的人工电子传递系统，包括来源于牛的肾上腺素Adx4
‑
108和来源大肠杆菌的铁氧还蛋白酶Fpr；所述肾上腺素Adx4
‑
108，其氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示；所述铁氧还蛋白酶Fpr，其氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示。3.一种能够生物降解黄体酮的基因工程菌株，其特征在于，所述基因工程菌株是在宿主细胞中对CYP260A1 S276I、Adx4
‑
108和Fpr的编码基因进行表达获得的。4.如权利要求3所述的基因工程菌株，其特征在于，将CYP260A1 S276I、Adx4
‑
108和Fpr的编码基因按照Fpr
‑
CYP
‑
Adx的顺序进行表达。5.如权利要求3所述的基因工程菌株，其特征在于，所述宿主细胞包括但不限于大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌。6.如权利要求3所述的基因工程菌株，其特征在于，通过将CYP260A1 S276I、Adx4
‑
108和Fpr的编码基因构建重组表达载体进行表达；所述重组表达载体使用的表达质粒包括但不限于pCDFDuet
‑
1、pET17b、pET22b、pET28a。7.如权利要求3所述的基因工程菌株，其特征在于，将CYP260A1 S276I、Adx4
‑
108和Fpr的编码基因按照Fpr
‑

【专利技术属性】
技术研发人员：毛淑红，路福平，李杰，秦慧民，孙静，王蓝蓝，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：