一种流感病毒疫苗的生产方法技术

本发明专利技术公开了一种禽流感病毒以及其它流感病毒如猪流感，犬流感，马流感疫苗的生产方法，包括如下步骤：（１）制苗用细胞的传代与培养；（２）制苗用毒种的繁殖；（３）ＭＤＣＫ细胞在生物反应器中的微载体悬浮培养；（４）制苗毒液的繁殖；（５）病毒液的收获。本发明专利技术可以大量降低生产成本，而且生产周期短，不会受制于原料供应，占用场地小，易于快速扩大生产规模，环境污染少且易于处理，自动化程度高，用人少，质量易于实现均衡稳定，显著提高疫苗产量和质量。

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
一种流感病毒疫苗的生产方法，其特征在于：　　选择生物反应器作为培养工具；选择微载体作为细胞贴附生长的载体；选择ＭＤＣＫ细胞作为制苗用细胞；　　并包括如下步骤：　　（１）制苗用细胞的传代与培养：取细胞培养瓶中生长良好的ＭＤＣＫ细胞，经ＥＤＴＡ－胰酶细胞分散液消化传代，以细胞生长液在细胞培养瓶中继续培养，培养温度为３７℃，形成良好细胞单层时，用于继续传代或接种于生物反应器中进行微载体悬浮培养；　　（２）制苗用毒种的繁殖：将基础毒种１０↑［－４］稀释，尿囊腔接种１１日龄ＳＰＦ鸡胚，０．１ｍｌ／枚，置３７℃孵化，每天照蛋２－４次，收获３６～９６小时死亡鸡胚的尿囊液，置－１８℃保存。将此病毒液作为生产种毒。　　（３）ＭＤＣＫ细胞在生物反应器中的微载体悬浮培养：取步骤（１）中已形成良好单层的细胞培养瓶上生长良好的ＭＤＣＫ细胞，经ＥＤＴＡ－胰酶细胞分散液消化制备为细胞悬液，细胞计数后按５×１０↑［５］／ｍｌ～５×１０↑［６］／ｍｌ的细胞密度接种于生物反应器中，在生物反应器中加有微载体，设定培养温度３７℃、ＰＨ６．８－７．６、溶氧３０％－６０％、搅拌速度３０－６０ｒｐｍ，进行反应器自动控制、微载体悬浮培养；　　（４）制苗毒液的繁殖：观察微载体上细胞基本长满，且细胞计数结果达到５×１０↑［６］／ｍｌ～５×１０↑［７］／ｍｌ后进行接毒操作，所接入种毒为步骤（２）中之生产种毒，接毒前用含有１０ｕｇ／ｍｌ胰酶的病毒培养液洗涤２－４次。设定培养温度３７℃、ＰＨ６．８－７．６、溶氧３０％－６０％、搅拌速度３０－６０ｒｐｍ，进行反应器自动控制培养，接毒后每隔一定时间取反应器中微载体，用显微镜观察细胞病变情况；　　（５）病毒液的收获：待微载体上细胞基本全部脱落，且ＤＯ值呈明显上升趋势，将反应器内液体连同微载体一起收获，置－２０℃反复冻融两次，然后经离心或过滤去除微载体及细胞碎片，即制得病毒液。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：高鹏，刘玉才，胡来根，王立斌，严成，徐志春，
申请(专利权)人：成都天邦生物制品有限公司，
类型：发明
国别省市：90[中国|成都]