一种双金属纳米酶介导的侧流免疫层析试纸及其检测方法技术

本发明专利技术公开了一种双金属纳米酶介导的侧流免疫层析试纸，所述试纸在检测线包被由双金属纳米酶标记的识别目标物的单克隆抗体，在质控线上包被第二抗体，本发明专利技术的基于双金属纳米酶介导的比色信号放大策略的免疫层析试纸条，装配简单，使用方便，能够快捷高效完成定性和定量检测，具有高灵敏度和高特异性；可同时检测多目标物，实现了广谱性的目标物即时检测，极大地节约了检测成本并且降低了检测限，在目标物检测领域具有普遍适用性，检测结果安全可靠。靠。靠。

【技术实现步骤摘要】
一种双金属纳米酶介导的侧流免疫层析试纸及其检测方法


[0001]本专利技术涉及一种侧流免疫层析试纸，尤其涉及一种双金属纳米酶介导的侧流免疫层析试纸，还涉及上述侧流免疫层析试纸的检测方法。

技术介绍

[0002]侧流免疫层析测定(LFIA)是一种基于抗原
‑
抗体特异性免疫反应原理的检测方法。LFIA具有实时分析、使用方便、价格低廉、特异性强、不需要专业人员操作等优点，被认为是最有前景的即时检测(POCT)平台之一，并且已经应用到食品安全检测、环境监测、以及疾病诊断等方面。传统比色模式的LFIA，如基于金纳米粒子(Au NPs)的LFIA(Au NPs
‑
LFIA)，其产生的比色信号可以用肉眼读取，使用起来非常简单和方便。然而，它有灵敏度低和定量能力有限的缺点，这限制了它在低浓度目标分析中的应用。比色信号放大策略可以改善LFIA中测试线(T
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line)上的颜色信号的强度，这确保了LFIA的高灵敏度，同时该颜色信号也可以用肉眼直接读取。其中，基于酶催化反应的比色信号放大技术受到广泛关注。
[0003]其中，双金属纳米酶由于两种金属之间的协同作用，表现出比单金属纳米酶更好的酶类活性。双金属纳米酶的Kcat通常为105‑
106s
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1，这比单金属纳米酶高100倍。这使得双金属纳米酶在催化显色底物3,3
′
,5,5
′‑
四甲基联苯胺(TMB)时能产生更强烈的颜色信号；在现有技术中，将双金属纳米酶与抗体偶联，制成检测探针应用于LFIA中，其虽然提高了检测的灵敏度，但是任不能满足要求，不能应用与痕量目标物的分析，而且由于其灵敏度不足，其需要大量的样品进行分析，难以满足家庭环境中的使用。其次，当应用于大规模筛查时，微量血样量(10μL)可以提高筛查过程的效率，需要具有高灵敏度、便携、简单易用的检测设备。CN114966000A公开了一种基于Au@Pd纳米酶的免疫层析试纸条及制备方法和应用，其采用Au@Pd纳米酶进行免疫层析试纸的应用，其使用的Au@Pd纳米酶的催化性能较低，且检测灵敏度较低。

技术实现思路

[0004]专利技术目的：本专利技术的目的在于提供一种双金属纳米酶介导的侧流免疫层析试纸，还提供了上述侧流免疫层析试纸的检测方法。
[0005]技术方案：本专利技术的双金属纳米酶介导的侧流免疫层析试纸，所述侧流免疫层析试纸包括平板、样品垫、硝酸纤维素膜和吸收垫，样品垫、硝酸纤维素膜和吸收垫依次粘贴在平板的单侧表面，所述硝酸纤维素膜的表面包被第一检测线、第二检测线及质控线，所述第一检测线上包被识别第一目标物的单克隆抗体mAb
‑
1P1，所述第二检测线上包被识别第二目标物的单克隆抗体mAb
‑
2P1；所述质控线上包被第二抗体，第二抗体与标记了第一目标物的单克隆抗体mAb
‑
1P2的检测探针和标记了第二目标物的单克隆抗体mAb
‑
2P2的检测探针相匹配。
[0006]优选的，所述第一检测线(3)上包被识别第一目标物的单克隆抗体mAb
‑
1P1，含量为30～45μg；所述第二检测线(4)上包被识别第二目标物的单克隆抗体mAb
‑
2P1，含量为30
～45μg。
[0007]优选的，所述双金属纳米酶为具有类酶活性的由两种金属组成的纳米颗粒，包括钯
‑
铱纳米颗粒(Pd@Ir NPs)、金
‑
铂纳米颗粒(Au@Pt NPs)或镍
‑
铂纳米颗粒(Ni@Pt NPs)。
[0008]优选的，所述第一目标物或第二目标物，包括疾病标志物、病原微生物或药物。
[0009]优选的，所述样品垫，为将聚酯膜采用含3～5％的蔗糖、0.05～2％的曲拉通100、0.05～0.1mol/L的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、磷酸缓冲盐溶液浸泡2～4h，在35～42℃烘1～3h。
[0010]上述免疫层析试纸条的制备方法具体为：
[0011](1)将吸水纸剪裁为宽20～30mm吸收垫；
[0012](2)硝酸纤维素膜的处理：将第一目标物的单克隆抗体mAb
‑
1P1、第二目标物的单克隆抗体mAb
‑
2P1配制喷涂液，用喷涂方式将其在硝酸纤维素膜上进行分别间隔喷涂，得到两条距离3～5mm的检测线；将二抗配成浓度为0.8～1.2mg/mL的喷涂液，用喷涂方式将其喷涂于硝酸纤维素膜上，与第二条检测的距离为3～5mm，与硝酸纤维素膜末端的距离为5～10mm；
[0013](3)将聚酯膜剪裁为宽20～30mm样品垫，并用含3～5％的蔗糖、0.05～2％的曲拉通
‑
100、0.05～0.1mol/L的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(pH 8.0)、磷酸缓冲盐溶液(pH 7.4)浸泡2～4h，在35～42℃烘1～3h；
[0014](4)将硝酸纤维素膜黏贴到聚氯乙烯背衬底板上，再从聚氯乙烯背衬底板的一侧向另一侧依次黏贴样品垫和吸收垫，样品垫和吸收垫分别与硝酸纤维素膜重叠2～4mm。
[0015]上述双金属纳米酶介导的侧流免疫层析试纸的检测方法，包括以下步骤：
[0016](1)Pd@Ir NPs的制备：在水中加入聚乙烯吡咯烷酮、抗坏血酸和溴化钾，超声使混合物溶解后，加热搅拌后离心收集产物，重悬得到黑色产物溶液。将聚乙烯吡咯烷酮、抗坏血酸溶于乙二醇，再加入得到的黑色产物溶液，加热回流，然后加入六氯铱酸钠溶液，继续回流，离心洗涤，用超纯水配成Pd@Ir NPs溶液备用。
[0017](2)取Pd@Ir NPs溶液，与识别第一目标物的单克隆抗体mAb
‑
1P2共孵育，在加入牛血清白蛋白，即得识别第一目标物的检测探针；
[0018](3)取Pd@Ir NPs溶液，与识别第二目标物的单克隆抗体mAb
‑
2P2共孵育，在加入牛血清白蛋白，即得识别第二目标物的检测探针。
[0019](4)取上述步骤制得的检测探针，加入待测样品中，混合均匀后，静置，得到目标物与相应检测探针形成的免疫复合物；
[0020](5)将步骤(4)得到的免疫复合物滴加于试纸条的样品垫，样品液在毛细管力的作用下往吸收垫移动，目标物能与硝酸纤维素膜上的检测线包被的检测抗体进行特异性抗原抗体识别，将Pd@Ir NPs聚集于检测线，待质控线显色后，在检测线处滴加催化显色液；一段时间后，用ColorPicker软件分析T线RGB值，与标准曲线对比，实现对待测样品中目标物浓度的定量判断。
[0021]优选的，步骤(2)中，所述Pd@Ir NPs溶液浓度为1～2mg/mL，识别第一目标物的单克隆抗体mAb
‑
1P2浓度为1～3mg/mL，孵育时间为4～6h。
[0022]优选的，步骤(3)中，所述Pd@Ir NPs溶液浓度为1～2mg/mL，识别第二本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种双金属纳米酶介导的侧流免疫层析试纸，其特征在于，所述侧流免疫层析试纸包括平板(7)、样品垫(1)、硝酸纤维素膜(2)和吸收垫(6)，样品垫(1)、硝酸纤维素膜(2)和吸收垫(6)依次粘贴在平板(7)的单侧表面，所述硝酸纤维素膜(2)的表面包被第一检测线(3)、第二检测线(4)及质控线(5)，所述第一检测线(3)上包被识别第一目标物的单克隆抗体mAb
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1P1，所述第二检测线(4)上包被识别第二目标物的单克隆抗体mAb
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2P1；所述质控线上包被山羊抗小鼠IgG，山羊抗小鼠IgG与标记了第一目标物的单克隆抗体mAb
‑
1P2的检测探针和标记了第二目标物的单克隆抗体mAb
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2P2的检测探针相匹配。2.根据权利要求1所述的侧流免疫层析试纸，其特征在于，所述第一检测线(3)上包被识别第一目标物的单克隆抗体mAb
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1P1；所述第二检测线(4)上包被识别第二目标物的单克隆抗体mAb
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2P1。3.根据权利要求1所述的侧流免疫层析试纸，其特征在于，所述双金属纳米酶为具有类酶活性的由两种金属组成的纳米颗粒，包括钯
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铱纳米颗粒、金
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铂纳米颗粒或镍
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铂纳米颗粒。4.根据权利要求1所述的侧流免疫层析试纸，其特征在于，所述第一目标物或第二目标物，包括疾病标志物、病原微生物或药物。5.根据权利要求1所述的侧流免疫层析试纸，其特征在于，所述样品垫，为将聚酯膜采用含3～5％的蔗糖、0.05～2％的曲拉通100、0.05～0.1mol/L的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、磷酸缓冲盐溶液浸泡2～4h，在35～42℃烘1
‑
3h。6.一种权利要求1所述的双金属纳米酶介导的侧流免疫层析试纸的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)Pd@Ir NPs的制备：在水中加入聚乙烯吡咯烷酮、抗坏血酸和溴化钾，超声使混合物溶解后，加热搅拌后离心收集产物，重悬...

【专利技术属性】
技术研发人员：鞠艳敏，戴建君，孟祥明，
申请(专利权)人：中国药科大学，
类型：发明
国别省市：