用于玉米赤霉烯酮的比色/荧光免疫检测试剂盒和方法技术

本发明专利技术公开了用于玉米赤霉烯酮的比色/荧光免疫检测试剂盒和方法，所述检测试剂盒包括酶标板、玉米赤霉烯酮抗原、玉米赤霉烯酮单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的IgG抗体、底物液和H2SO4，其中底物液包括PPD、PTA

【技术实现步骤摘要】
用于玉米赤霉烯酮的比色/荧光免疫检测试剂盒和方法


[0001]本专利技术属于玉米赤霉烯酮(ZEN)检测
，具体涉及一种基于二氨基对苯二甲酸(PTA
‑
NH2)和对苯二胺(PPD)的比色/荧光双模式免疫检测玉米赤霉烯酮的检测试剂盒和新检测方法。

技术介绍

[0002]玉米赤霉烯酮(Zearalenone，ZEN)是镰刀菌属真菌产生的一种有毒次生代谢产物，主要污染玉米、高粱、小麦、大麦等粮谷类作物，且在食品及饲料加工过程中也不易被破坏。ZEN具有诱变性、致畸性、致癌性、肾毒性、免疫毒性和遗传毒性，可通过污染谷类等农作物进入人或动物体内，危害任何动物的健康。目前大部分国家对食品、谷物、饲料中的ZEN含量都有十分严格的规定，如澳大利亚规定谷物中玉米赤霉烯酮的含量不能超过0.05mg/kg，意大利规定在谷物和谷类产品中玉米赤霉烯酮的含量不能超过0.1mg/kg，法国规定植物油和谷类当中玉米赤霉烯酮的含量必须低于0.2mg/kg。
[0003]玉米赤霉烯酮的分析测定一般采用薄层色谱法(TLC)、酶联吸附免疫法(ELISA)、高效液相色谱法(HPLC)和液相色谱
‑
质谱分析(LC
‑
MS)。TLC法繁琐费时，且灵敏度、特异性较差，提取过程中所需有机溶剂品种多且量大，易污染环境，对人体有较大危害。常规的HPLC法虽然比TLC灵敏度高，但由于样品前处理手续繁琐，操作复杂，不宜推广。LC
‑
MS是ZEN的国际标准分析方法，该方法具有良好的精确度、灵敏度和可重复性，但由于需要专业的分析人员来操作仪器和复杂的样品处理方法，不足以进行大规模和现场的快速分析。
[0004]因此，需要开发高灵敏度、快速简便的方法来检测食品样品和饲料产品中残留的ZEN含量。

技术实现思路

[0005]基于此，本专利技术旨在提供一种新的灵敏准确、简单易行的双模式免疫分析法检测ZEN。
[0006]本专利技术的技术方案具体如下：
[0007]本专利技术第一方面提供了一种用于玉米赤霉烯酮的比色/荧光双模式免疫检测试剂盒，包括酶标板，玉米赤霉烯酮抗原，玉米赤霉烯酮单克隆抗体(Ab1)，辣根过氧化物酶标记的IgG(记为HPR
‑
IgG)抗体，底物液和H2SO4，其中底物液包括PPD、PTA
‑
NH2、H2O2和缓冲液。
[0008]优选地，在上述检测试剂盒中，玉米赤霉烯酮抗原为牛血清白蛋白偶联ZEN的完全抗原(记为ZEN
‑
BSA)。
[0009]基于上述检测试剂盒，本专利技术第二方面构建了用于玉米赤霉烯酮的比色/荧光双模式免疫检测方法，具体包括以下步骤：
[0010]S1、将玉米赤霉烯酮抗原包被在酶标板上；
[0011]S2、将待测样品与Ab1同时加入S1制备的酶标板中，孵育后洗涤拍干；
[0012]S3、加入HPR
‑
IgG，孵育后洗涤拍干；
[0013]S4、加入底物液孵育后，先在360nm激发光下记录426nm处的荧光强度，再加入H2SO4，记录415nm处的吸光度；
[0014]S5、根据荧光强度、吸光度和标准曲线计算待测样本中玉米赤霉烯酮的浓度。
[0015]优选地，在上述检测方法中，步骤S1具体为：将玉米赤霉烯酮抗原用CBS缓冲液稀释后，加入酶标板中孵育，用PBST缓冲液(PBS缓冲液+Tween 20)洗涤后拍干。
[0016]在上述检测方法中，玉米赤霉烯酮抗原包被时的最佳工作浓度以及步骤S2中Ab1的最佳工作浓度可以通过棋盘滴定法确定，具体可将荧光强度和OD
415
值突变较大的、抗原抗体浓度较小的ZEN
‑
BSA和Ab1浓度确定为最适的工作浓度。在本专利技术一实施例的条件下，ZEN
‑
BSA和Ab1的最适工作浓度都为250ng/mL。
[0017]更为优选地，在上述检测方法中，玉米赤霉烯酮抗原在酶标板中的孵育条件为：室温下(20～30℃)孵育50～100min，其中60min为最佳。
[0018]优选地，在上述检测方法中，待测样品的制备方法为：向ZEN污染的样品中加入甲醇
‑
水溶液，超声提取后离心取上清液。在实际检测过程中，若样品中ZEN含量过高，可采用PBS缓冲液稀释上清液至合适浓度后，再进行检测。
[0019]优选地，在上述检测方法中，步骤S3具体为：用PBST缓冲液稀释HPR
‑
IgG，加入酶标板室温孵育后，洗涤拍干。HPR
‑
IgG的最佳工作浓度具体可以选择荧光强度最小、阳性孔OD
415
的平均值/阴性孔OD
415
(P/N值)(P(positive)值为正常实验加样品后的信号值，N(negative)值为不加抗体，其他什么都加的信号值，由于没有抗体，没有任何反应，故为本底对照信号值)。最大对应的HRP
‑
IgG浓度。在本专利技术一实施例的条件下，HPR
‑
IgG的最适工作浓度为140ng/mL。优选地，在上述检测方法中，底物液具体为包含50mM PPD、2μM PTA
‑
NH2和4mM H2O2的10mM PBS缓冲液。
[0020]优选地，在上述检测方法中，步骤S4中底物液的孵育时间应选择荧光强度最小、P/N值最大对应的时间确定作为最适的底物作用时间。在本专利技术的一实施例中，底物液在常温下的最佳孵育时间为20min。
[0021]优选地，在上述检测方法中，步骤S5中的标准曲线包括荧光法标准曲线方程和比色法标准曲线方程，其中：
[0022]荧光法标准曲线方程以玉米赤霉烯酮浓度的对数为横坐标，F/F0为纵坐标；F为采用不同浓度玉米赤霉烯酮标准品做待测样品时所得的荧光强度值(F
426
)，F0为采用玉米赤霉烯酮浓度为零的标准品做待测样品时所得的荧光强度值(F
426
)；在本专利技术一实施例中，该曲线方程为Y＝1.310+0.135X，R2＝0.996，检测范围为0.012ng/mL～3.125ng/mL；
[0023]比色法标准曲线方程以玉米赤霉烯酮浓度的对数为横坐标，抑制率为纵坐标；抑制率(％)＝[1－(OD
A
－OD
对照
)/OD
A
]×
100％，OD
对照
为采用玉米赤霉烯酮浓度为零的标准品时为待测样品时所得的吸光度值(OD
415
)，OD
A
为采用不同浓度玉米赤霉烯酮标准品做待测样品时所得的吸光度值(OD
415
)；在本专利技术一实施例中，该曲线方程为Y＝49.517+32.884X，R2＝0.995，检测范围为：0.048ng/mL～3.125ng/mL。
[0024]本专利技术通过将ic
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ELISA模式本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于玉米赤霉烯酮的比色/荧光双模式免疫检测试剂盒，其特征在于，包括酶标板，玉米赤霉烯酮抗原，玉米赤霉烯酮单克隆抗体，辣根过氧化物酶标记的IgG抗体，底物液和H2SO4，其中底物液包括PPD、PTA
‑
NH2、H2O2和缓冲液。2.根据权利要求1所述的比色/荧光双模式免疫检测试剂盒，其特征在于，所述玉米赤霉烯酮抗原为偶联有牛血清白蛋白的玉米赤霉烯酮。3.根据权利要求1所述的比色/荧光双模式免疫检测试剂盒，其特征在于，所述缓冲液为PBS缓冲液。4.一种用于玉米赤霉烯酮的比色/荧光双模式免疫检测方法，其特征在于，利用权利要求1所述的检测试剂盒进行检测，具体包括以下步骤：S1、将玉米赤霉烯酮抗原包被在酶标板上；S2、将待测样品与玉米赤霉烯酮单克隆抗体同时加入S1制备的酶标板中，孵育后洗涤拍干；S3、加入辣根过氧化物酶标记的IgG抗体，孵育后洗涤拍干；S4、加入底物液孵育后，在360nm激发光下记录426nm处的荧光强度，再加入H2SO4，记录415nm处的吸光度；S5、根据荧光强度、吸光度和标准曲线计算待测样本中玉米赤霉烯酮的浓度。5.根据权利要求4所述的比色/荧光双模式免疫检测方法，其特征在于，所述标准曲线包括：以玉米赤霉烯酮浓度的对数为横坐标，F/F0为纵坐标的荧光法标准曲线，其中，F为不同浓度玉米赤霉烯酮存在下的荧光强...

【专利技术属性】
技术研发人员：周玉，杨华林，吴世祥，李培武，张奇，张兴平，唐晓倩，
申请(专利权)人：中国农业科学院油料作物研究所，
类型：发明
国别省市：